쥐 좌측 폐 이식을 위한 간단한 커프 기술

요약

본 프로토콜은 마우스 왼쪽 폐 이식 모델을 위한 커프 기술을 설명합니다. 이 기술은 수년에 걸쳐 개발되어 왔으며 면역학 연구에서 효과적으로 작동하여 우수한 성과를 거두었습니다.

초록

지난 10년 동안 저희 실험실은 효율적이고 신뢰할 수 있는 이식 "커프 기술"을 사용하여 혈관화된 마우스 폐 이식 모델을 개발하고 개선하는 데 상당한 진전을 이루었습니다. 이 논문은 현재까지 마우스 폐 이식의 가장 생리학적, 임상적으로 관련성이 높은 모델을 나타내는 혈관화된 정소성 폐 모델에서 정교하고 포괄적인 정교하고 포괄적인 정교성 폐 이식 방법을 설명합니다. 이식 과정은 두 가지 뚜렷한 단계로 구성됩니다: 기증자 적출과 수혜자에 대한 후속 착상. 이 방법은 성공적으로 마스터되었으며 몇 달간의 충분한 교육을 통해 숙련된 시술자가 피부에서 피부로 약 90분 만에 절차를 수행할 수 있습니다. 놀랍게도, 일단 개인이 초기 학습 곡선을 극복하면 수술 전후 기간 동안의 생존율은 거의 100%에 가깝습니다. 마우스 모델은 상업적으로 이용 가능한 여러 형질전환 및 돌연변이 마우스 균주를 사용할 수 있도록 하여 내성 및 거부에 대한 연구를 가능하게 합니다. 또한 이 모델의 고유한 기능으로 인해 종양 생물학 및 면역학을 조사하는 데 유용한 도구가 됩니다.

서문

신부전 및 심부전 환자를 위한 투석 및 심실 보조 장치와 같은 대체 요법이 존재하지만, 폐 이식은 말기 폐 질환을 앓고 있는 환자를 위한 일차적인 치료 옵션으로 남아 있습니다. 이 절차는 폐섬유증¹ 진단을 받은 개인의 생명을 구하는 유일한 선택으로 작용합니다. 또한, 폐기종과 같은 말기 폐쇄성 폐 질환에 직면한 사람들과 낭포성 섬유증과 같은 화농성 질환을 앓고 있는 사람들의 수명을 연장하기 위해 사용됩니다¹.

기술적 개선, 수술 전후 관리 개선, 면역 억제의 발전으로 인해 단기 생존율이 향상되었지만, 폐 이식 후 장기 생존율은 다른 고형 장기에 비해 현저히 열등하다. 폐 이식 이식 환자의 5년 전체 생존율은 50%에 불과하며, 이는 심장, 신장 또는 간 동종이^{식술을 받은} 환자보다 훨씬 낮다1. 우리 팀과 다른 연구진은 생리학적으로 관련된 마우스 모델의 실험적 조작이 다른 고체 또는 세포 동종이식의 장기 생존에 크게 기여했기 때문에 폐 동종이식 거부 반응 및/또는 내성으로 이어지는 경로를 완전히 이해할 수 있는 임상적으로 관련된 생물학적 모델이 부족하기 때문이라고 의심했습니다².

마우스 정소성 폐 이식 모델을 개발하기 전에 연구자들은 연구를 위해 더 큰 동물 모델에 의존했습니다. 그러나 이러한 대규모 모델에는 기계론적 질문을 탐구하는 데 필요한 형질전환 돌연변이가 부족하다는 등 한계가 있었습니다³. 또한, 쥐 연구도^{유사한 한계에} 직면했으며4, 생쥐를 대상으로 한 비혈관화된 이종소 기관 이식 모델도 효용성에 국한되었다⁵. 연구에 따르면 다양한 장기 시스템에서 비혈관화된 모델 대신 혈관화된 이식 모델을 사용하는 것이 중요하다는 사실이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 수혜자 마우스의 귓바퀴에 삽입된 신생아 심장 조직의 비혈관화된 이식편은 혈관 내피 및 수혜자 혈류와의 직접적인 상호 작용이 부족합니다. 그러므로, 혈관화된 인간 심장 이식편에 비해 관련성이 제한적이다⁶. 유사한 방식으로, 혈관형성 및 통기가 없는 이소성 기관 이식 모델은 특히 이식 후 작은 기도에서 관찰된 기도 변화에서 인간 폐 이식과 상당한 차이가 있습니다. 더욱이, 이종소성 기관 동종이식편에서 섬유성 폐색의 급속한 발병은 인간의 폐 또는 더 큰 동물이나 쥐의 혈관화된 폐 이식편에서 관찰된 관찰을 반영하지 않는다⁷.

우리 연구실에서 orthotopic mouse lung 이식 모델의 생성은 쥐 ^8,9에서 확립된 orthotopic single lung 이식 모델에서 영감을 받았습니다. 인간과 달리 생쥐와 쥐는 왼쪽 폐에 엽이 하나뿐이며 전체 폐 질량의 25%에 불과합니다. 이 기능은 순환 보조를 필요로 하지 않고 쥐 모델에서 좌측 폐 이식을 성공적으로 실행할 수 있게 한다^10,11. 시간이 지남에 따라 모델에 기술적 수정을 도입했으며, 이러한 맥락에서 절차 수행의 용이성을 향상시키는 핵심 단계가 설명됩니다.

이식 면역생물학 연구에서의 함의를 넘어, 정소성 마우스 폐 이식 모델은 다양한 질병 과정에서 폐 비조혈 기질 세포의 역할을 탐구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 이는 돌연변이 syngeneic single lung 이식은 조혈 세포를 수용자 유래 세포로 거의 완전히 대체하는 반면, 비조혈 기질 세포는 계속해서 기증자에서 유래하기 때문에 발생합니다. 결과적으로, "키메라 기관(chimeric organ)"은 숙주 조사나 전이유전자의 폐 특이적 발현 없이 생성될 수 있다¹². 더욱이, 반대쪽의 천연 폐는 숙주의 면역 체계에 광범위한 변화를 일으키지 않고 동일한 동물 내에서 내부 대조군으로 기능할 수 있습니다. 이 모델은 폐 이식 및 폐 기질 세포와 관련된 기타 질병 경로에 대한 연구를 발전시키는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다.

프로토콜

모든 동물 관련 절차는 볼티모어에 있는 메릴랜드 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었으며 승인을 받았습니다. 수컷, 8-12주(20-25g), BALB/c 마우스를 기증자로 사용하고 C57BL/6 마우스를 수혜자로 사용하는 것이 좋습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조).

1. 기관지 및 혈관 커프의 준비

타이밍 : 10 분 (커프 3 개)

1. 18G 혈관카테터를 사용하여 기관지 커프를 준비하고 길이가 1mm인 20G 혈관카테터(확장 핸들 제외)를 사용하여 폐정맥 커프를 준비합니다( 재료표 참조). #11 메스와 혈관 카테터의 금속 바늘을 절단면 역할을 합니다(그림 1).
2. 비슷한 방법으로 길이가 0.6mm인 24G 혈관테터( 재료표 참조)를 사용하여 폐동맥 커프를 준비합니다.
   참고: 미세혈관 문합을 만들기 위한 커프 기술의 일반적인 기본 원칙은 다음과 같습니다: 마우스 폐 이식을 위한 미세혈관 문합을 확립할 때, 혈관의 크기가 작기 때문에 특정 커프 기술이 사용됩니다. 직접 봉합할 수 있는 큰 혈관과 달리, 미세한 기관지 및 혈관 연결에는 뚜렷한 방법이 필요합니다. 기본 원리는 혈관 자체보다 약간 큰 단단한 원형 커프를 통해 기증자 혈관을 통과시키는 것입니다.

2. 기증자 절차

타이밍 : 10-15 분

1. 기증자 마우스를 마취하기 위해 50mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진( 재료 표 참조)의 복강내(IP) 주사를 투여합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
2. 발가락 꼬집기를 통해 적절한 마취를 확인한 후 기증자 마우스를 면도하고 10배 배율로 작동 현미경 아래 누운 자세로 놓습니다.
3. 음경 정맥을 통해 50uL의 헤파린( 재료 표 참조)을 주입합니다(그림 2A).
4. 기관을 절개하고 20G 혈관 카테터를 삽입한 다음 6-0 실크 봉합사로 둘러쌉니다( 재료 표 참조). 카테터를 인공호흡기에 연결합니다(그림 2B).
5. 복부 정중선 절개술(개복술)을 시행하고 횡격막을 둘레 절개합니다(그림 2C).
6. 정중선 흉골절개술¹² 를 실시하고 흉골 양쪽에 두 개의 집게를 배치하여 지혈과 뼈 가장자리의 후퇴를 위해 합니다(그림 2D).
7. 흉선을 제거하고 좌우 심방 부속물을 절제하여 폐에서 배출되는 배액을 용이하게 합니다.
8. 폐에서 모든 혈액을 씻어내기 위해 3mL 주사기에 27G 바늘을 사용하여 시중에서 판매되는 4°C의 차가운 보존 용액 3mL( 재료 표 참조)를 우심실 또는 폐동맥근에 직접 주입합니다.
   참고: 뇌실 내 또는 폐동맥 주사는 기증자의 폐에 손상을 입힐 수 있습니다. 보존 용액의 균일한 분포를 보장하기 위해 세척 시 적절한 환기를 유지하는 것이 중요합니다.
9. 기관을 근방으로 고정한 다음 기관을 원위부로 나눕니다. 다음으로, 기관을 꼬리와 뒤로 해부한다¹².
10. 심폐 차단을 제거하고 멸균 및 냉기 보존 용액으로 적신 거즈를 깐 작은 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 이 페트리 접시를 얼음으로 채워진 더 큰 접시에 넣습니다(그림 2E).
11. 왼쪽 폐를 노출시키려면 좌측 및 우측 폐 조직에 작은 거즈를 삽입하여 수축시킵니다(그림 2F).
12. 곡선형 집게를 사용하여 정밀하게 고구 구조를 서로 부드럽게 분리합니다. 기관지에서 좌측 폐동맥(PA)을 절개합니다(그림 2G). 다음으로 유사한 방식으로 기관지에서 hilum의 가장 꼬리 쪽에 위치한 폐정맥(PV)을 해부합니다(그림 2H).
    1. 적절한 커핑을 위해 가능한 가장 긴 길이로 PA와 PV를 자릅니다. 과도한 지방이나 림프 조직을 절제하면 커핑 단계를 수행하기 어려울 수 있으므로 피하십시오.
13. 안정화 cl을 사용하여 PV 커프를 폐동맥 위로 약 2mm 위치에 놓습니다.amp, 그런 다음 커프 내부에 PV를 삽입합니다. PV를 커프 위로 접어 내피 표면이 노출되도록 합니다(그림 2I). 10-0 봉합사(2노트)로 커프 주위에 고정합니다(그림 2J).
14. PA를 hilum에서 멀리 나누고 동일한 방식으로 PA에 커프를 놓습니다.
    알림: 이 단계에서 기관지를 자르지 마십시오. 대신, 보관 시 보존 용액이 기도로 들어가는 것을 방지하기 위해 이식 직전에 기관지에 커프를 채우십시오. 폐 블록을 4°C의 온도에서 보존 용액에 담그십시오.

3. 수취인 절차

타이밍 : 50-60 분

1. 케타민(50mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물로 수혜자 마우스를 마취(복강내)(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 다음으로 왼쪽 가슴을 면도하고 삽관을 합니다¹².
2. 입에서 혀를 부드럽게 빼내어 성대를 노출시킴으로써 직접적인 시야 아래에서 삽관을 수행합니다. 해부 범위에서 10배 배율로 이 작업을 수행합니다. 성대 사이에 20G x 1.25" 혈관 테터를 직접 삽입하여 동물을 삽관합니다.
3. 동물을 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓고 70% 에탄올로 흉벽을 청소합니다. (그림 3A).
4. 가위를 사용하여 피부를 절개하고 전기로 왼쪽 개흉술을 완전히 완료합니다( 재료 표 참조).
   참고: 이 단계에서 흉벽의 출혈을 최소화하려면 이 절개의 모든 부분에 전기 소작술을 사용하십시오. 전기소작술은 에탄올과 결합할 경우 화상의 위험이 있으므로 에탄올로 닦은 후 피부를 건조시켜야 합니다.
5. 3^번째 또는 4^번째 늑간 공간에서 흉부로 들어가 두 개의 흉부 견인기를 배치합니다( 재료 표 참조)(그림 3B).
6. 개흉술 후 마우스를 누운 자세로 전환합니다. 마우스 몸체를 약간 구부려 왼쪽 가슴을 작업자에게 더 가깝게 만들어 힐럼의 시야를 향상시켜 가시성과 접근성을 향상시킵니다.
7. 수혜자의 왼쪽 폐에 직각 동맥 겸자(6인치)를 놓고 폐를 부드럽게 후퇴시킵니다. 이는 전방 하이럼의 노출을 허용하여 추가적인 외과적 접근과 조작을 용이하게 합니다(그림 3C).
8. 구부러진 해부 겸자를 사용하여 기관지에서 폐동맥(PA)을 절개하여 혈관이 찢어지지 않도록 합니다. 최적의 해부 위치는 중간 부분이며 2mm의 거리로 충분합니다(그림 3D).
9. 비슷한 방식으로 기관지에서 PV를 해부합니다(그림 3E).
10. 수혜자의 왼쪽 폐 기류와 혈류를 막기 위해 동맥류 마이크로클립( 재료 표 참조)을 문턱 기저부에 배치합니다(그림 3F).
11. 마이크로가위를 사용하여 이식자의 폐동맥(PA)과 폐정맥(PV)을 작은 V자 절개를 만듭니다. 직선 또는 곡선 겸자를 사용하여 기관지와 혈관 구멍을 부드럽게 확장하여 기증자 커프를 배치하기 위한 적절한 구멍을 만듭니다.
12. 희석된 헤파린(헤파린: 식염수 = 1:9)으로 부드럽게 씻어내어 혈액을 제거합니다.
13. PA 주위에 10-0 나일론을 놓고 느슨하게 둡니다(나중에 커프를 고정하기 위해tage).
14. 그런 다음 기증자 기관지를 자르고 PA 및 PV와 유사한 방식으로 수갑을 채웁니다. 기증자 오른쪽 폐-심장 차단을 폐기합니다.
15. 수혜자의 왼쪽 폐를 잡고 기증자 폐를 수축 집게 위에 놓고 작고 촉촉한 거즈로 덮습니다.
    참고: 수혜자의 왼쪽 폐는 수혜자 고관절에 장력을 가할 수 있는 위치에 유지되어야 하며, 이를 통해 문합 과정을 용이하게 해야 합니다.
16. 커프가 채워진 문턱 구조를 앞쪽으로 노출시키고 커프를 아래쪽으로 잡고 기증자를 수혜자 폐동맥(PA)에 삽입하여 문합을 시작합니다. 이 시점에서 공여자의 PA는 약간의 스트레칭을 경험하게 됩니다(그림 3G).
17. 기증자 폐동맥(PA)이 수혈 PA에 배치되면 커프 확장부를 가로질러 마이크로클립을 배치하여 구조를 고정합니다. 다음으로, 이전에 배치된 10-0 나일론 봉합사를 수혜자 폐동맥(PA)과 커프 주위에 두 개의 매듭으로 고정합니다( 그림 3H 참조). 마지막으로 확장 커프에서 마이크로클립을 분리합니다.
18. 비슷한 방식으로 기증자의 PV를 수혜자의 PV에 삽입합니다(그림 3I).
19. 기증자 기관지를 수혜자 기관지에 삽입하여 기증자 기관지가 약간 늘어나도록 합니다(그림 3J). 관류와 환기를 회복하기 위해 hilum에 마이크로클립을 놓습니다(그림 3K).
20. 흉강에 기증자의 폐를 삽입하고 수혜자의 폐동맥(PA), 폐정맥(PV) 및 기관지의 나머지 부분을 전방으로 절단하여 수혜자의 왼쪽 폐를 절제합니다(그림 3L). 수혜자의 왼쪽 폐를 처분하십시오.
21. 6-0 PDS 봉합사를 사용하여 가슴을 봉합하고( 재료 표 참조) 개흉술 절개 부위 아래 갈비뼈 하나와 위쪽 갈비뼈 하나를 고정합니다. 상자를 닫기 직전에 동물에게 큰 숨을 한 번 불어넣어 가슴에 남아 있는 공기를 배출합니다.
    참고: 쥐 모델과 달리 생쥐에 흉관을 삽입할 필요가 없습니다.
22. 연속 피하 6-0 실크 봉합사를 사용하여 피부와 그 아래 피하 조직을 봉합합니다( 재료 표 참조).

4. 동물 회복

타이밍 : 12 시간

1. 동물이 밤새 작은 동물 ICU(휴대용 동물 집중 치료실, 재료 표 참조)에서 음식과 물을 제한 없이 이용할 수 있도록 합니다.
2. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 12시간마다 부프레노르핀을 0.5-1mg/kg씩 투여합니다.

결과

지난 10년 동안 이 모델에 대한 경험에 비추어 볼 때, 기본적인 미세수술 기술을 가진 개인은 일반적으로 약 50마리의 동물에 대한 학습 곡선이 필요합니다. 숙련도가 달성되면 기증자 절차는 일반적으로 15-30분이 소요되며 수혜자 절차는 약 60분이 소요됩니다. 초기 학습 곡선 이후에는 수술 전후 사망률이 매우 낮은 경향이 있습니다.

?...

토론

쥐 좌측 폐 이식을 위한 커프 기술은 이식 연구에서 중요한 진전을 나타냅니다^10,11. 중요한 단계에는 정확하고 세심한 문턱 구조 해부 및 안전한 문합이 포함됩니다. 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있지만 학습 곡선이 필요합니다. 우리 그룹은 수용 마우스의 위치를 후방에서 전방으로 수정하여 수용 마우스를 구부려 학습 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001