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Method Article
본 프로토콜은 마우스 왼쪽 폐 이식 모델을 위한 커프 기술을 설명합니다. 이 기술은 수년에 걸쳐 개발되어 왔으며 면역학 연구에서 효과적으로 작동하여 우수한 성과를 거두었습니다.
지난 10년 동안 저희 실험실은 효율적이고 신뢰할 수 있는 이식 "커프 기술"을 사용하여 혈관화된 마우스 폐 이식 모델을 개발하고 개선하는 데 상당한 진전을 이루었습니다. 이 논문은 현재까지 마우스 폐 이식의 가장 생리학적, 임상적으로 관련성이 높은 모델을 나타내는 혈관화된 정소성 폐 모델에서 정교하고 포괄적인 정교하고 포괄적인 정교성 폐 이식 방법을 설명합니다. 이식 과정은 두 가지 뚜렷한 단계로 구성됩니다: 기증자 적출과 수혜자에 대한 후속 착상. 이 방법은 성공적으로 마스터되었으며 몇 달간의 충분한 교육을 통해 숙련된 시술자가 피부에서 피부로 약 90분 만에 절차를 수행할 수 있습니다. 놀랍게도, 일단 개인이 초기 학습 곡선을 극복하면 수술 전후 기간 동안의 생존율은 거의 100%에 가깝습니다. 마우스 모델은 상업적으로 이용 가능한 여러 형질전환 및 돌연변이 마우스 균주를 사용할 수 있도록 하여 내성 및 거부에 대한 연구를 가능하게 합니다. 또한 이 모델의 고유한 기능으로 인해 종양 생물학 및 면역학을 조사하는 데 유용한 도구가 됩니다.
신부전 및 심부전 환자를 위한 투석 및 심실 보조 장치와 같은 대체 요법이 존재하지만, 폐 이식은 말기 폐 질환을 앓고 있는 환자를 위한 일차적인 치료 옵션으로 남아 있습니다. 이 절차는 폐섬유증1 진단을 받은 개인의 생명을 구하는 유일한 선택으로 작용합니다. 또한, 폐기종과 같은 말기 폐쇄성 폐 질환에 직면한 사람들과 낭포성 섬유증과 같은 화농성 질환을 앓고 있는 사람들의 수명을 연장하기 위해 사용됩니다1.
기술적 개선, 수술 전후 관리 개선, 면역 억제의 발전으로 인해 단기 생존율이 향상되었지만, 폐 이식 후 장기 생존율은 다른 고형 장기에 비해 현저히 열등하다. 폐 이식 이식 환자의 5년 전체 생존율은 50%에 불과하며, 이는 심장, 신장 또는 간 동종이식술을 받은 환자보다 훨씬 낮다1. 우리 팀과 다른 연구진은 생리학적으로 관련된 마우스 모델의 실험적 조작이 다른 고체 또는 세포 동종이식의 장기 생존에 크게 기여했기 때문에 폐 동종이식 거부 반응 및/또는 내성으로 이어지는 경로를 완전히 이해할 수 있는 임상적으로 관련된 생물학적 모델이 부족하기 때문이라고 의심했습니다2.
마우스 정소성 폐 이식 모델을 개발하기 전에 연구자들은 연구를 위해 더 큰 동물 모델에 의존했습니다. 그러나 이러한 대규모 모델에는 기계론적 질문을 탐구하는 데 필요한 형질전환 돌연변이가 부족하다는 등 한계가 있었습니다3. 또한, 쥐 연구도유사한 한계에 직면했으며4, 생쥐를 대상으로 한 비혈관화된 이종소 기관 이식 모델도 효용성에 국한되었다5. 연구에 따르면 다양한 장기 시스템에서 비혈관화된 모델 대신 혈관화된 이식 모델을 사용하는 것이 중요하다는 사실이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 수혜자 마우스의 귓바퀴에 삽입된 신생아 심장 조직의 비혈관화된 이식편은 혈관 내피 및 수혜자 혈류와의 직접적인 상호 작용이 부족합니다. 그러므로, 혈관화된 인간 심장 이식편에 비해 관련성이 제한적이다6. 유사한 방식으로, 혈관형성 및 통기가 없는 이소성 기관 이식 모델은 특히 이식 후 작은 기도에서 관찰된 기도 변화에서 인간 폐 이식과 상당한 차이가 있습니다. 더욱이, 이종소성 기관 동종이식편에서 섬유성 폐색의 급속한 발병은 인간의 폐 또는 더 큰 동물이나 쥐의 혈관화된 폐 이식편에서 관찰된 관찰을 반영하지 않는다7.
우리 연구실에서 orthotopic mouse lung 이식 모델의 생성은 쥐 8,9에서 확립된 orthotopic single lung 이식 모델에서 영감을 받았습니다. 인간과 달리 생쥐와 쥐는 왼쪽 폐에 엽이 하나뿐이며 전체 폐 질량의 25%에 불과합니다. 이 기능은 순환 보조를 필요로 하지 않고 쥐 모델에서 좌측 폐 이식을 성공적으로 실행할 수 있게 한다10,11. 시간이 지남에 따라 모델에 기술적 수정을 도입했으며, 이러한 맥락에서 절차 수행의 용이성을 향상시키는 핵심 단계가 설명됩니다.
이식 면역생물학 연구에서의 함의를 넘어, 정소성 마우스 폐 이식 모델은 다양한 질병 과정에서 폐 비조혈 기질 세포의 역할을 탐구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 이는 돌연변이 syngeneic single lung 이식은 조혈 세포를 수용자 유래 세포로 거의 완전히 대체하는 반면, 비조혈 기질 세포는 계속해서 기증자에서 유래하기 때문에 발생합니다. 결과적으로, "키메라 기관(chimeric organ)"은 숙주 조사나 전이유전자의 폐 특이적 발현 없이 생성될 수 있다12. 더욱이, 반대쪽의 천연 폐는 숙주의 면역 체계에 광범위한 변화를 일으키지 않고 동일한 동물 내에서 내부 대조군으로 기능할 수 있습니다. 이 모델은 폐 이식 및 폐 기질 세포와 관련된 기타 질병 경로에 대한 연구를 발전시키는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다.
모든 동물 관련 절차는 볼티모어에 있는 메릴랜드 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었으며 승인을 받았습니다. 수컷, 8-12주(20-25g), BALB/c 마우스를 기증자로 사용하고 C57BL/6 마우스를 수혜자로 사용하는 것이 좋습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조).
1. 기관지 및 혈관 커프의 준비
타이밍 : 10 분 (커프 3 개)
2. 기증자 절차
타이밍 : 10-15 분
3. 수취인 절차
타이밍 : 50-60 분
4. 동물 회복
타이밍 : 12 시간
지난 10년 동안 이 모델에 대한 경험에 비추어 볼 때, 기본적인 미세수술 기술을 가진 개인은 일반적으로 약 50마리의 동물에 대한 학습 곡선이 필요합니다. 숙련도가 달성되면 기증자 절차는 일반적으로 15-30분이 소요되며 수혜자 절차는 약 60분이 소요됩니다. 초기 학습 곡선 이후에는 수술 전후 사망률이 매우 낮은 경향이 있습니다.
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쥐 좌측 폐 이식을 위한 커프 기술은 이식 연구에서 중요한 진전을 나타냅니다10,11. 중요한 단계에는 정확하고 세심한 문턱 구조 해부 및 안전한 문합이 포함됩니다. 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있지만 학습 곡선이 필요합니다. 우리 그룹은 수용 마우스의 위치를 후방에서 전방으로 수정하여 수용 마우스를 구부려 학습 ?...
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ASK, AEG 및 DK는 P01 AI116501에서 지원됩니다. ASK 및 EJ는 R01AI145108-01, R01HL166402에서 추가로 지원됩니다. ASK는 I01 BX002299-05에서 지원됩니다. AEG 및 DK는 RO1HL09601에서 추가로 지원됩니다. CL은 R01 HL128492에서 지원됩니다. 이 작업은 Chuck과 Mary Meyers, Richard와 Eibhlin Henggeler에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | Surgical Specialties Corporation, Reading PA | AK-0106 | |
2 Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 11251-20 | |
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91309-12 | |
6-0 braided silk suture | Henry Schein Inc., Melville, NY, | 100-5597 | |
6-0 Polydioxanone PDS II suture and | Ethicon Inc., Somerville, NJ. | Z117H | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc., Brookfield, CT | 111000140 | |
Adson forceps | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91127-12 | |
Balb/c mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000651 | 8–12 weeks; Male |
Bipolar coagulator | Valleylab Inc., Boulder, CO | SurgII-20, E6008/E6008B | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | 8–12 weeks; Male |
Clear chlorhexidine | Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA | 57591 | |
Electrocautery | Bovie | ||
Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15000-03 | |
Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 91201-13 | |
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 55-7040 | settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume |
Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL | 504031 | 100 U/mL |
Injection grade normal saline | Hospira Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4888-20 | |
Ketamine | VetOne, Boise, ID | 501072 | 50 mg/kg |
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws | Medline, Northfield, IL, | MDS1247714 | Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm) |
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip | Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ | 10 450 290 | |
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 15396-00 | |
Moria extra fine spring scissors | Parkland Scientific, Coral Springs, FL | V3000i | |
Ohio Isoflurane Vaporizer | Vitrolife Inc., Englewood, CO, | 19001 | |
Perfadex low-potassium dextran glucose solution | Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ | 353025 | Electrolyte preservation solution |
polystyrene petridishes | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 00632-11 and 00649-11 | 150 × 25 mm and 60 × 25 mm |
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip | Fine Science Tools Inc., Foster City, CA | 18200-20 | |
Small animal retraction system | Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine | 823-WC | tapered mini cotton tipped 3 inch applicators |
sterile Q-tips | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2419Z | |
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX1851Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2" | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD | SROX2032Z | |
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25" | Thermocare, Inc., Incline Village, NV | ||
ThermoCare Small Animal ICU System, | A to Z Vet Supply, Dresden, TN | 008679 | 10 mg/kg |
Xylazine | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT480T | |
Yasargil Clip Applier | Aesculap, Inc., Center Valley, PA, | FT264T | |
Yasargil Temporary Aneurysm Clips | Medline, Northfield, IL, | ESCT001 |
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