Простая техника наложения манжеты при трансплантации левого легкого у мышей

Резюме

В настоящем протоколе описана техника использования манжеты для модели трансплантации левого легкого у мыши. Этот метод разрабатывался в течение нескольких лет и хорошо зарекомендовал себя, эффективно служа в иммунологических исследованиях.

Аннотация

За последнее десятилетие наша лаборатория добилась значительного прогресса в разработке и совершенствовании моделей васкуляризированной трансплантации легких мышей с использованием эффективной и высоконадежной «манжетной техники» трансплантации. В данной статье описывается сложный и комплексный метод ортотопической трансплантации легких в васкуляризированной ортотопической модели легкого, представляющий собой наиболее физиологическую и клинически значимую модель трансплантации легких мышей на сегодняшний день. Процесс трансплантации состоит из двух отдельных этапов: забор донора и последующая имплантация реципиенту. Метод был успешно освоен, и после нескольких месяцев достаточного обучения опытный практикующий специалист может выполнить процедуру примерно за 90 минут от кожи к коже. Удивительно, но как только люди преодолевают начальную кривую обучения, выживаемость в периоперационном периоде приближается почти к 100%. Мышиная модель позволяет использовать несколько коммерчески доступных трансгенных и мутантных штаммов мышей, что позволяет изучать толерантность и отторжение. Кроме того, уникальные особенности этой модели делают ее ценным инструментом для изучения биологии опухолей и иммунологии.

Введение

В то время как заместительная терапия, такая как диализ и желудочковые вспомогательные устройства, существуют для пациентов с почечной и сердечной недостаточностью, трансплантация легких остается основным вариантом лечения для пациентов, страдающих терминальной стадией легочной болезни. Эта процедура служит единственным спасительным выбором для людей с диагнозом легочный фиброз¹. Кроме того, он используется для продления продолжительности жизни тех, кто сталкивается с терминальной стадией обструктивных заболеваний легких, таких как эмфизема, а также тех, кто страдает гнойными состояниями, такими как муковисцидоз¹.

В то время как краткосрочные показатели выживаемости улучшились благодаря техническим усовершенствованиям, усовершенствованию периоперационного ухода и достижениям в области иммуносупрессии, долгосрочные результаты после трансплантации легких заметно уступают таковым при других солидных органах. Общая пятилетняя выживаемость реципиентов легочного трансплантата составляет всего 50%, что намного ниже, чем у тех, кто получает аллотрансплантаты сердца, почек или печени¹. Наша команда и другие специалисты подозревают, что причиной такого расхождения является отсутствие клинически значимых биологических моделей для полного понимания путей, ведущих к отторжению и/или толерантности к аллотрансплантату легких, поскольку экспериментальные манипуляции с физиологически значимыми мышиными моделями внесли значительный вклад в долгосрочную выживаемость других твердых или клеточных аллотрансплантатов^.

До разработки мышиной модели ортотопической трансплантации легких исследователи полагались на более крупные животные модели для своих исследований. Тем не менее, эти более крупные модели имели ограничения, в том числе отсутствие трансгенных мутантов, необходимых для изучения механистических^{вопросов.} Кроме того, исследования на крысах столкнулись с аналогичными ограничениями⁴, а неваскуляризированные гетеротопические модели трансплантации трахеи у мышей также были ограничены их полезностью⁵. Исследования показали важность использования васкуляризированных трансплантатов вместо неваскуляризированных в различных системах органов. Например, неваскуляризированные трансплантаты неонатальной сердечной ткани, вставленные в ушную раковину мышей-реципиентов, не имеют прямого взаимодействия с эндотелием сосудов и кровотоком реципиента. Поэтому их актуальность ограничена по сравнению с васкуляризированными сердечными трансплантатами человека⁶. Аналогичным образом, модель гетеротопной трансплантации трахеи, в которой отсутствует васкуляризация и аэрация, значительно отличается от трансплантации легких человека, особенно в наблюдаемых изменениях дыхательных путей в мелких дыхательных путях после трансплантации. Более того, быстрое начало фиброзной окклюзии в гетеротопических аллотрансплантатах трахеи не отражает наблюдений в легких человека или в васкуляризированных трансплантатах легких у более крупных животных или^крыс7.

В нашей исследовательской лаборатории создание ортотопической модели трансплантации легких у мышей было вдохновлено ортотопической моделью трансплантации одного легкого, установленной на крысах ^8,9. В отличие от людей, мыши и крысы имеют только одну долю в левом легком, составляющую всего двадцать пять процентов от общей массы легких. Эта функция позволяет успешно выполнять трансплантацию левого легкого на мышиных моделях без необходимости поддержки кровообращения^10,11. Со временем мы внесли технические изменения в модель, и в этом контексте были выяснены ключевые шаги, которые повышают простоту выполнения процедуры.

Помимо своего значения в исследованиях в области трансплантационной иммунобиологии, ортотопическая модель трансплантации легких у мышей предлагает надежный инструмент для изучения роли легочных негемопоэтических стромальных клеток в различных патологических процессах. Это происходит потому, что мутантный сингенный трансплантат одного легкого приводит к почти полной замене гемопоэтических клеток на клетки, полученные от реципиента, в то время как негемопоэтические стромальные клетки продолжают происходить от донора. Следовательно, «химерный орган» может быть создан без облучения хозяина или специфической для легких экспрессии трансгена¹². Более того, нативное легкое противоположной стороны может функционировать как внутренний контроль в пределах одного и того же животного, не вызывая широкомасштабных изменений в иммунной системе хозяина. Эта модель имеет большие перспективы для продвижения исследований в области трансплантации легких и других путей заболевания, связанных с тромбальными клетками легочной артерии.

протокол

Все процедуры, связанные с животными, проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Мэриленд в Балтиморе и получили от него одобрение. Рекомендуется использовать самцов мышей BALB/c в возрасте 8-12 недель (20-25 г) в качестве донора и мышей C57BL/6 в качестве реципиента. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка бронхиальных и сосудистых манжет

Хронометраж: 10 мин (для трех манжет)

1. Подготовьте бронхиальную манжету с помощью ангиокатетера 18 G и легочную венозную манжету с помощью ангиокатетера 20 G длиной 1 мм (без учета удлинительной ручки) (см. Таблицу материалов). Используйте скальпель #11 и металлическую иглу ангиокатетера, служащую режущей поверхностью (Рисунок 1).
2. Препарируйте манжету легочной артерии с помощью ангиокатетера 24 G длиной 0,6 мм (см. Таблицу материалов) аналогичным образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общие фундаментальные принципы манжетной методики создания микрососудистых анастомозов заключаются в следующем: при создании микрососудистых анастомозов для трансплантации легких мышей используются специфические манжетные техники в связи с малыми размерами сосудов. В отличие от более крупных сосудов, которые могут быть сшиты напрямую, микроскопические бронхиальные и сосудистые соединения требуют отдельного метода. Основополагающий принцип заключается в прохождении донорского сосуда через жесткую круглую манжету, которая немного больше самого сосуда.

2. Процедура донорства

Хронометраж: 10-15 мин

1. Внутрибрюшинное введение 50 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов) для обезболивания донорской мыши (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
2. После обеспечения адекватной анестезии путем защемления пальцев ног побрейте мышь-донора и поместите ее в лежачее положение под операционный микроскоп с 10-кратным увеличением.
3. Введите 50 мкл гепарина (см. Таблицу материалов) через вену полового члена (рис. 2А).
4. Разрежьте трахею и вставьте ангиокатетер 20 G, а затем обвите его шелковым швом 6-0 (см. Таблицу материалов). Подсоедините катетер к аппарату искусственной вентиляции легких (рисунок 2B).
5. Выполните разрез по средней линии живота (лапаротомию) и сделайте круговой разрез в области диафрагмы (рисунок 2C).
6. Проведите стернотомию по средней линии¹² и расположите два щипца по обе стороны от грудины для гемостаза и ретракции от краев кости (рисунок 2D).
7. Удалите тимус и иссеките придатки правого и левого предсердий, чтобы облегчить выход любых дренажей из легких.
8. Введите 3 мл холодного раствора для консервации 4 °C (см. Таблицу материалов) непосредственно в правый желудочек или корень легочной артерии с помощью иглы 27 г на шприце объемом 3 мл, чтобы смыть всю кровь из легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрижелудочковая инъекция или инъекция легочной артерии может привести к повреждению донорского легкого. Крайне важно поддерживать достаточную вентиляцию во время промывки, чтобы обеспечить равномерное распределение консервационного раствора.
9. Зажмите трахею проксимально, а затем разделите трахею дистально. Далее рассекаем трахею каудально и^{сзади 12}.
10. Снимите блок искусственного кровообращения и переложите его в маленькую чашку Петри, стерильную и застеленную марлей, смоченной раствором для холодной консервации. Затем поместите эту чашку Петри в большую чашку, наполненную льдом (Рисунок 2E).
11. Чтобы обнажить левый волосок, наложите небольшую марлю на ткани левого и правого легких для ретракции (рисунок 2F).
12. Аккуратно отделите прикорневые структуры друг от друга с помощью изогнутых щипцов с точностью. Рассеките левую легочную артерию (ЛК) от бронха (Рисунок 2G). Затем рассеките легочную вену (ЛВ), расположенную в самой каудальной части ворот от бронха аналогичным образом (рис. 2H).
    1. Разрежьте PA и PV на максимально возможной длине для правильного застегивания манжет. Старайтесь избегать иссечения чрезмерного количества жира или лимфоидной ткани, так как это может затруднить выполнение операции с манжетами.
13. Расположите ФВ-манжету примерно на 2 мм над легочной артерией с помощью стабилизирующего зажима, а затем вставьте ФВ внутрь манжеты. Сложите PV над манжетой, тем самым обнажив эндотелиальную поверхность (рисунок 2I). Закрепите его вокруг манжеты швом 10-0 (2 узла) (Рисунок 2J).
14. Отделите ПА от ворот и положите манжету на ПА таким же образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от разрезания бронхов на этом этапе. Вместо этого обязательно наденьте манжету на бронх непосредственно перед имплантацией, чтобы предотвратить попадание консервирующего раствора в дыхательные пути во время хранения. Погрузите легочный блок в консервационный раствор при температуре 4 °C.

3. Порядок действий получателя

Хронометраж: 50-60 мин

1. Обезболите мышь-реципиента смесью кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) (внутрибрюшинно) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Далее побрейте левую грудную клетку и интубируйте¹².
2. Проводите интубацию под прямым наблюдением, осторожно вытягивая язык изо рта и тем самым обнажая голосовые связки. Выполняйте это под препарирующим эндоскопом с 10-кратным увеличением. Интубируйте животное, вставив ангиокатетер размером 20 г x 1,25 дюйма непосредственно между голосовыми связками.
3. Поместите животное в правое боковое положение пролежня и очистите грудную стенку 70% этанолом. (Рисунок 3А).
4. С помощью ножниц сделайте надрез на коже и полностью завершите левую торакотомию с помощью электрокаутера (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потерю крови от грудной стенки во время этого этапа, используйте электрокаутеризацию для всех частей этого диссекции. Кожу необходимо высушить после протирания этанолом, так как электрокоагуляция несет риск получения ожогов при сочетании с этанолом.
5. Войдите в грудную клетку с^3-го или^4-го межреберья и поставьте два ретрактора грудной клетки (см. Таблицу материалов) (рисунок 3Б).
6. После торакотомии переведите мышь в положение лежа на спине. Слегка согните корпус мыши-получателя, чтобы приблизить левую грудь к оператору, улучшив обзор ворот для улучшения видимости и доступности.
7. Расположите щипцы для артерии под прямым углом (6 дюймов) на левом легком получателя и аккуратно втяните легкое. Это позволяет обнажить переднюю часть ворот, облегчая дальнейший хирургический доступ и манипуляции (Рисунок 3C).
8. Отделите легочную артерию (ПА) от бронха с помощью изогнутых щипцов для рассечения, следя за тем, чтобы не порвать сосуд. Оптимальным местом рассечения является средняя часть, достаточно расстояния в 2 мм (рисунок 3D).
9. Аналогичным образом отделите ПВ от бронхов (рис. 3E).
10. Чтобы затруднить воздушный поток и кровоток в левом легком реципиента, поместите микрозажим для аневризмы (см. Таблицу материалов) у основания ворот (рис. 3F).
11. Сделайте небольшой V-образный разрез в легочной артерии (ПА) и легочной вене (ВП) реципиента с помощью микроножниц. Аккуратно расширьте бронхиальные и сосудистые отверстия с помощью прямых или изогнутых щипцов, чтобы создать подходящее отверстие для установки донорских манжет.
12. Аккуратно промойте разведенным гепарином (гепарин: физраствор = 1:9), чтобы удалить кровь.
13. Поместите нейлон 10-0 вокруг PA и оставьте его свободным (для фиксации манжет на более позднем этапе).
14. Затем разрежьте донорский бронх и завяжите его манжетой аналогично PA и PV. Откажитесь от донорской правой легочно-сердечной блокады.
15. Удерживая левое легкое реципиента, расположите донорское легкое поверх ретракционных щипцов и накройте его небольшой влажной марлей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левое легкое реципиента должно оставаться в положении, позволяющем оказывать напряжение на плечо реципиента, тем самым облегчая процесс анастомоза.
16. Спереди обнажите прикорневые структуры манжеты и начните анастомоз, поместив донора в легочную артерию (ПА) реципиента, при этом нижним образом удерживая манжету. На этом этапе ПА донора будет испытывать некоторое растяжение (Рисунок 3G).
17. После того, как донорская легочная артерия (ПА) расположена в ПА реципиента, закрепите структуры, поместив микрозажим поперек удлинителя манжеты. Затем закрепите ранее установленный нейлоновый шов 10-0 вокруг легочной артерии (ПА) реципиента и манжету двумя узлами (см. рисунок 3H). Наконец, отделите микрозажим от удлинительной манжеты.
18. Аналогичным образом вставьте ЧВ донора в ЛВ реципиента (Рисунок 3I).
19. Вставьте донорский бронх в бронх реципиента, следя за тем, чтобы донорский бронх находился под некоторым растяжением (рисунок 3J). Отпустите микрозажим на воротах, чтобы восстановить перфузию и вентиляцию (Рисунок 3K).
20. В грудную полость введите донорское легкое и иссеките левое легкое реципиента, разрезав оставшиеся части легочной артерии реципиента (PA), легочной вены (PV) и бронха спереди (рис. 3L). Утилизируйте левое легкое реципиента.
21. Закройте грудную клетку с помощью шва 6-0 PDS (см. Таблицу материалов), тем самым закрепив одно ребро ниже и одно ребро выше разреза грудной клетки. Непосредственно перед тем, как закрыть грудную клетку, сделайте одному большому вдоху, чтобы выпустить оставшийся воздух из грудной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от модели крысы, мышам нет необходимости вставлять плевральные дренажные трубки.
22. Сшить кожу и подлежащую подкожную клетчатку с помощью непрерывного подкожного шелкового шва 6-0 (см. Таблицу материалов).

4. Восстановление животных

Хронометраж: 12 ч

1. Дайте животному восстановиться с неограниченным доступом к пище и воде в отделении интенсивной терапии для мелких животных (портативном отделении интенсивной терапии для животных, см. Таблицу материалов) в течение ночи.
2. Бупренорфин вводят подрано (0,5-1 мг/кг) каждые 12 ч для минимизации послеоперационной боли.

Результаты

Основываясь на опыте работы с этой моделью за последние 10 лет, особям с базовыми навыками микрохирургии обычно требуется кривая обучения примерно в 50 животных. После того, как уровень владения языком достигнут, процедуры для доноров обычно занимают 15-30 минут, в то врем...

Обсуждение

Техника «манжеты» для трансплантации левого легкого у мышей представляет собой значительный шаг вперед в исследованиях в области трансплантации^10,11. Важнейшие шаги включают точное и тщательное рассечение прикорневой структуры и безо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001