精液中过氧化物酶阳性白细胞的检查

摘要

本文提出了一种经济有效的治疗精液中过氧化物酶阳性白细胞的方法。在计算机辅助精液分析（CASA）系统的辅助下，可以在总共60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，有效提高了男科实验室和男科医生的效率。

摘要

白细胞精子症可导致精子活力降低、精子形态异常增加、精子DNA片段化指数升高、精子顶体功能受损，甚至影响胚胎发育。它是临床实践中常见的男科疾病，也是男性不育的重要原因之一。在确定是否存在男性生殖道炎症时，男科医生通常选择检查精液中的圆形细胞或精浆弹性蛋白酶作为临床诊断依据。然而，圆形细胞的检查很容易受到脱落的生精细胞和生殖道上皮细胞的影响，这无助于减少抗生素的不分青红皂白和不必要的使用。同时，弹性蛋白酶的检测过程相对复杂、耗时、报告结果缓慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断和治疗。我们创新地将计算机辅助精液分析（CASA）系统辅助的精液中过氧化物酶阳性白细胞的检测作为白细胞精子症的诊断标准，成功解决了这些问题。该检查只需将四种试剂组成的操作液加入标本中，室温下的总反应时间可控制在20-30min以内。通过随后的涂片和显微镜检查，可以在总共60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，可用于诊断男性生殖道是否存在炎症。

引言

不孕不育已成为一个全球公共卫生问题，影响着大约15%的育龄夫妇。男性因素约占总不孕症病例的50%，近20%至30%可仅归因于男性因素^1,2,3。男性生殖道感染 （MGTI） 是男性不育的重要原因之一，约占病例的 15% ^4,5。

大多数人的精液中有白细胞，占非精子细胞的 13%，中性粒细胞占 12%，巨噬细胞占 0.9%，淋巴细胞占 0.1%^6,7。根据世界卫生组织 （WHO） 人类精液检查和处理实验室手册（第 5 版），白细胞精子症通常定义为精液中存在 >1 × 10⁶ 个细胞/mL^{白细胞 8}。这种情况可能由许多因素引起，例如环境毒素、药物滥用、精索静脉曲张、MGTI 等，所有这些都可能导致精液中白细胞浓度异常升高⁹.白细胞可提高精液中的活性氧 （ROS） 水平，导致脂质过氧化和蛋白质和 DNA 的氧化损伤，从而导致精子活力降低、精子形态异常....

研究方案

本研究已通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会评审批准。

1.工作溶液的制备

1. 收集以下制备工作溶液所必需的试剂 - 邻甲苯胺底物溶液、饱和氯化铵 （NH₄Cl） 溶液、148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐 （Na₂EDTA） 溶液和 6% （v/v） 过氧化氢溶液。将它们与必要的工具一起放在室温 （RT） 实验室工作台上，例如移液器（1000 μL、200 μL、10 μL）和试管架。
   注意：在处理上述试剂之前，请阅读安全数据表 （SDS）。
2. 准备一个不透明的棕色试剂瓶，以储存和保护制备的工作溶液免受光线照射。
3. 按照以下指定的比例将试剂转移到不透明的棕色试剂瓶中：
   1. 使用 200 μL 移液器，转动旋钮将刻度调节至 100 μL。然后，将 100 μL NH₄Cl 溶液转移到不透明的棕色试剂瓶中。
   2. 更换移液器吸头，并使用上述200 μL移液管将100 μL 148 mmol/L Na₂EDTA溶液转移到不透明的棕色试剂瓶中。然后，用移液轻轻吹气，使溶液彻底均质化。
   3. 使用 1000 μL 移液管，转动旋钮将刻度调节至 900 μL。然后，将900μL邻甲苯胺底物溶液转移到不透明的棕色试剂瓶中，用移液轻轻吹气，并使溶液彻底匀浆。

讨论

邻甲苯胺和过氧化氢具有光敏性，暴露在光线下会分解。为确保测试试剂的有效性，建议将制备的工作液存放在黑暗的地方。

精液样本自然表现出异质性特征。在精液样品的制备过程中，正确判断精液的液化状态，并在每次取样前对精液样品进行彻底均质化，对于提高检测结果的可靠性至关重要。精液样品在15分钟内完全液化。如果它们在60分钟后仍未完全液化，则应考虑机.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE	Microptic S.L.	1222996; Model type: SCA-SCOPE-H	Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL)	Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD	2210009	Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL)	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20221101	Polymer-based pipette
Electronic counter	None	None	A multichannel counter
Electronic scales	Shanghai Liangping Instrument Co., LTD	D9008084	MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber	Makler	MQ30004	0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope	Olympus	3G41067201307	CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia C
Pipet tips(1 mL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	02923205	1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	00323961	1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	32822810	1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia A
SCA counting chamber	Microptic S.L.	102230608	10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20230701	Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table	Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD	MQ30004	MQ-300
Transfer pipette (10 µL)	Eppendoff	3121000.015
Transfer pipette (1000 µL)	Eppendoff	3121000.12
Transfer pipette (200 µL)	Eppendoff	3121000.082
Two-dimensional shaker	DragonLab	822000010000	VC5A002205