Исследование пероксидаз-положительных лейкоцитов в сперме

Резюме

В данной работе представлен экономичный и эффективный протокол исследования пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме. С помощью системы автоматизированного анализа спермы (CASA) можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в течение 60 минут, эффективно повышая эффективность работы андрологической лаборатории и андрологов.

Аннотация

Лейкоцитоспермия может привести к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже к нарушению эмбрионального развития. Это распространенное андрологическое заболевание в клинической практике и одна из важных причин мужского бесплодия. При определении наличия воспаления мужского репродуктивного тракта андрологи часто выбирают исследование круглых клеток или семенной плазменной эластазы в сперме в качестве клинико-диагностической основы. Однако на исследование круглых клеток легко влияют отшелушивающиеся сперматогенные клетки и эпителиальные клетки репродуктивного тракта, которые не способствуют уменьшению беспорядочного и ненужного применения антибиотиков. В то же время процесс обнаружения эластазы является относительно сложным, трудоемким и медленным в получении результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как инфекции мужских половых путей (МГТИ). Мы инновационно применили исследование пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме с помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) в качестве диагностического критерия лейкоцитоспермии, успешно решив эти проблемы. Это исследование требует только добавления рабочей жидкости, состоящей из четырех реагентов, в образец, а общее время реакции при комнатной температуре можно контролировать в течение 20-30 минут. При последующем мазке и микроскопическом исследовании можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в общей сложности в течение 60 мин, что может быть использовано для диагностики наличия воспаления мужских половых путей.

Введение

Бесплодие стало глобальной проблемой общественного здравоохранения, затрагивающей примерно 15% пар в репродуктивном возрасте. Мужские факторы составляют около 50% от общего числа случаев субфертильности, и почти 20-30% могут быть отнесены исключительно к мужским факторам ^1,2,3. Инфекции мужских половых путей (МГТИ) являются одной из значимых причин мужского бесплодия, составляя около 15% случаев ^4,5.

У большинства людей лейкоциты в сперме составляют 13% несперматозоидных клеток, с дифференциальными пропорциями: нейтрофилы 12%, макрофаги 0,9% и лимфоциты 0,1%^6,7. Согласно лабораторному руководству Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке спермы человека (5-е изд.), лейкоцитоспермия обычно определяется как наличие >1 × 10⁶ клеток/мл лейкоцитов в сперме⁸. Это состояние может быть вызвано многочисленными факторами, такими как токсины окружающей среды, злоупотребление психоактивными веществами, варикоцеле, MGTI и т. д., которые потенциально могут привести к аномальному увеличению концентрации лейкоцитов в сперме⁹. Лейкоциты могут повышать уровень активных форм кислорода (АФК) в сперме, вызывая перекисное окисление липидов и окислительное повреждение белка и ДНК, что приводит к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже негативному влиянию на развитие эмбриона^10,11.

В настоящее время андрологи обычно выбирают исследование круглых клеток в сперме или эластазы в семенной плазме при выявлении воспаления половых путей. Тем не менее, часто бывает сложно отличить отшелушивающиеся сперматогенные клетки от эпителиальных клеток репродуктивного тракта, которые не способствуют сокращению беспорядочного и ненужного использования антибиотиков⁶. Последний метод обследования является относительно сложным и трудоемким, с медленным получением результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как MGTI. Американская урологическая ассоциация (AUA) предлагает проводить дальнейшую дифференциацию между лейкоцитами и отшелушенными клетками из половых путей, когда концентрация круглых клеток в спермограмме превышает 1 × 10⁶ клеток/мл¹². Некоторые андрологические лаборатории используют проточную цитометрию¹³ или иммуноцитохимию лейкоцитарного антигена (например, CD45)¹⁴ для исследования лейкоцитов. Несмотря на то, что эти методы являются точными, они являются дорогостоящими и трудоемкими, что затрудняет их широкомасштабное клиническое внедрение, особенно в развивающихся странах.

Пероксидаза широко распространена в различных типах клеток и играет решающую роль в устойчивости к окислительному стрессу. Миелопероксидаза (МПО) является членом подсемейства пероксидаза, которое обычно экспрессируется в иммунных клетках. Он наиболее высоко экспрессируется в азурофильных гранулах нейтрофилов^15,16, а также в лимфоцитах^17,18, моноцитах и макрофагах¹⁹. Концентрацию лейкоцитов, особенно нейтрофилов, в сперме можно получить, исследуя круглые клетки, которые являются пероксидазоположительными ^7,20. Чтобы сделать процесс исследования лейкоцитов в сперме экономичным, удобным и эффективным, мы модернизировали метод исследования. С помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) концентрация лейкоцитов может быть получена в течение 60 минут. Этот новый метод снижает затраты на обследование пациентов и время ожидания получения результатов, снижает нагрузку на лаборантов, сокращает время ожидания диагноза и лечения у врача.

протокол

Это исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по медицинской этике Третьей филиальной больницы Университета Сунь Ятсена.

1. Приготовление рабочего раствора

1. Подготовьте следующие реагенты, необходимые для приготовления рабочего раствора: раствор ортотолуидинового субстрата, раствор насыщенного хлорида аммония (NH₄Cl), раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА) 148 ммоль/л и 6% раствор перекиси водорода. Поместите их на лабораторный стол при комнатной температуре вместе с необходимыми инструментами, такими как пипетки для переноса (1000 мкл, 200 мкл, 10 мкл) и штативы для пробирок.
   ВНИМАНИЕ: Прочтите паспорт безопасности (SDS) перед использованием вышеупомянутых реагентов.
2. Подготовьте непрозрачный флакон с реагентом коричневого цвета для хранения и защиты приготовленного рабочего раствора от воздействия света.
3. Переложите реагенты в непрозрачный коричневый флакон с реагентом в соответствии с пропорциями, указанными ниже:
   1. Используйте пипетку для переноса на 200 мкл и отрегулируйте шкалу до 100 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 100 мкл раствора NH₄Cl в непрозрачный коричневый флакон с реагентом.
   2. Замените наконечник пипетки и перелейте 100 мкл раствора_Na2ЭДТА 148 ммоль/л в непрозрачный коричневый флакон с реагентом с помощью пипетки для переноса 200 мкл, упомянутой выше. Затем осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор.
   3. Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу до 900 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 900 мкл раствора ортотолуидинового субстрата в непрозрачный коричневый флакон с реагентом, осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор.
   4. Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 5 мкл, повернув ручку. Затем перелейте 5 мкл 6%-ного (v/v) раствора перекиси водорода в непрозрачный коричневый флакон с реагентом.
4. Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу на 1000 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, осторожно продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте раствор в непрозрачном коричневом флаконе с реагентом.
5. Храните готовый к использованию рабочий раствор в непрозрачном коричневом флаконе с реагентом в RT, вдали от света. Рабочий раствор реакционноспособен в течение 24 ч.
6. На каждый образец спермы требуется 900 мкл рабочего раствора. Следите за тем, чтобы количество рабочего раствора, приготовленного каждый день, соответствовало количеству образцов, исследуемых ежедневно.

2. Подготовка образца спермы

1. Перед сбором образца спермы убедитесь, что пациент воздерживался от эякуляции в течение 2-7 дней, как того требует лабораторное руководство Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке спермы человека (5-е изд.). ⁸. Мастурбация является предпочтительным методом получения образцов спермы. Чтобы повысить точность исследования, поручите пациенту собрать всю эякулированную сперму.
2. Включите подставку с постоянной температурой и заранее нагрейте до 37 °C, чтобы последующее разжижение образца спермы могло протекать гладко.
3. После получения образца спермы пациента тщательно запишите подробную информацию, включая идентификационный код, время сбора, продолжительность воздержания и другую соответствующую информацию, на внешней стенке сосуда на полимерной основе.
4. Поместите сосуд на полимерной основе, в котором находится образец спермы, на подставку с постоянной температурой, предварительно нагретую до 37 °C, что благоприятно для разжижения спермы.
5. Наберите образец спермы в пипетку на полимерной основе и наблюдайте за состоянием разжижения каждые 5 мин до тех пор, пока образец спермы не станет полностью жидким.
6. Если образец спермы не был полностью разжижен в течение 30 минут, исследование пока не проводить; Продолжайте ждать еще 30 мин. Если сперма все еще не полностью разжижена через 60 минут, добавьте равный объем фосфатного буферного раствора для разведения 1:1 и осторожно взболтайте, чтобы способствовать разжижению.
7. После тщательного перемешивания и последовательной гомогенизации сохраните полностью разжиженный образец спермы для последующих процедур исследования.

3. Окрашивание пероксидазоположительных лейкоцитов и анализ исходного образца спермы

1. Перед отбором проб используйте пипетку на полимерной основе, чтобы многократно продуть пипеткой и тщательно гомогенизировать исследуемый образец спермы.
2. Используйте пипетку для переноса на 200 мкл и отрегулируйте шкалу до 100 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, а затем перелейте 100 мкл образца спермы в центрифужную пробирку.
3. Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу до 900 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, затем перелейте 900 мкл вышеупомянутого рабочего раствора в центрифужную пробирку.
4. Многократную продувку пипеткой и тщательную гомогенизацию реагента, состоящего из образца спермы и рабочего раствора, с помощью трансферной пипетки на 1000 мкл.
5. Поместите центрифужную пробирку в штатив для пробирок на двухмерный шейкер и подвергните ее непрерывному перемешиванию при 200 об/мин в течение 30 мин при RT.
6. В ожидании реакции окрашивания проанализируйте образец спермы с помощью системы CASA для определения концентрации сперматозоидов в исходном образце спермы в сосуде на полимерной основе.
   1. Включите выключатель питания системы CASA и дважды щелкните значок SCA SCOPE, чтобы открыть прикладное программное обеспечение.
   2. Перед отбором проб многократно продуйте пипеткой и снова тщательно гомогенизируйте исходный образец спермы с помощью пипетки на полимерной основе.
   3. Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 10 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, наберите на 10 мкл исходного образца спермы и поместите его в счетную камеру SCA. Подождите 60 секунд, чтобы образец спермы перестал дрейфовать.
   4. Расположите счетную камеру SCA на держателе образца системы CASA и введите информацию о пациенте в диалоговом окне прикладного программного обеспечения для подготовки к формальному исследованию.
   5. Исследуйте исходный образец спермы в камере подсчета SCA с помощью системы CASA, нажав кнопку «Пуск », и запишите необходимые данные, такие как концентрация сперматозоидов.

4. Наблюдение за пероксидазоположительными лейкоцитами и сперматозоидами

1. Используйте пипетку для переноса на 1000 мкл и отрегулируйте шкалу на 1000 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, затем несколько раз продуйте пипеткой и тщательно гомогенизируйте реагент, который состоит из образца спермы и рабочего раствора в центрифужной пробирке, снова в конце 30-минутного процесса реакции.
2. Используйте пипетку для переноса на 10 мкл и отрегулируйте шкалу до 10 мкл, повернув ручку. Замените наконечник пипетки, намочите 10 мкл упомянутого выше реагента и поместите его в камеру для подсчета сперматозоидов. Наконец, накройте камеру для подсчета сперматозоидов специальным стеклянным покровным листом.
3. Поместите камеру для подсчета сперматозоидов на микроскопический столик и включите выключатель питания оптического микроскопа с двумя 10-кратными окулярами. Затем подождите 60 с, пока образец реагента не прекратит дрейфовать.
4. Переключите микроскопический конвертер на объектив с 10-кратным увеличением во время ожидания. Затем последовательно отрегулируйте ручку грубой регулировки и ручку точной регулировки. Наконец, понаблюдайте за сперматозоидами и круглыми клетками при увеличении 10×10.
5. Переключите микроскопический конвертер на линзу объектива 40x после определения поля зрения, подлежащего анализу, и наблюдайте за сперматозоидами и коричневыми пероксидазоположительными лейкоцитами при увеличении 10 × 40.
6. Используйте электронную систему счетчика для подсчета не менее 200 сперматозоидов и количества бурых пероксидазоположительных лейкоцитов в соответствующих полях.

5. Расчет концентрации пероксидазоположительных лейкоцитов

1. Рассчитайте концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов по следующей формуле:
   

Результаты

После выполнения вышеупомянутой процедуры реагент в центрифужной пробирке часто проявляет субпрозрачный опалесцирующий вид (Рисунок 1). Обнаружение явно коричневого цвета свидетельствует о потенциальной дегрануляции лейкоцитов, что может привести к окрашиванию жидк...

Обсуждение

Орто-толуидин и перекись водорода обладают светочувствительными свойствами и могут разлагаться под воздействием света. Для обеспечения эффективности испытуемых реагентов приготовленную рабочую жидкость рекомендуется хранить в темном месте.

Образцы спермы, естестве?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE	Microptic S.L.	1222996; Model type: SCA-SCOPE-H	Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL)	Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD	2210009	Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL)	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20221101	Polymer-based pipette
Electronic counter	None	None	A multichannel counter
Electronic scales	Shanghai Liangping Instrument Co., LTD	D9008084	MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber	Makler	MQ30004	0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope	Olympus	3G41067201307	CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia C
Pipet tips(1 mL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	02923205	1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	00323961	1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	32822810	1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia A
SCA counting chamber	Microptic S.L.	102230608	10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20230701	Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table	Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD	MQ30004	MQ-300
Transfer pipette (10 µL)	Eppendoff	3121000.015
Transfer pipette (1000 µL)	Eppendoff	3121000.12
Transfer pipette (200 µL)	Eppendoff	3121000.082
Two-dimensional shaker	DragonLab	822000010000	VC5A002205