בדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני ויעיל לבדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז בזרע תוך 60 דקות בסך הכל, ובכך לשפר ביעילות את היעילות של מעבדה אנדרולוגית ואנדרולוגים.

Abstract

לוקוציטוספרמיה יכולה להוביל לירידה בתנועתיות הזרעונים, הפרעות מורפולוגיות מוגברות בזרעונים, עלייה במדד פיצול ה- DNA של הזרעונים, פגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים, ואפילו התפתחות עוברית מושפעת. זוהי מחלה אנדרולוגית נפוצה בפרקטיקה הקלינית ואחד הגורמים החשובים לאי פוריות הגבר. כאשר קובעים אם קיימת דלקת בדרכי הרבייה הגברית, אנדרולוגים בוחרים לעתים קרובות לבחון תאים עגולים או אלסטאז פלזמה זרע בזרע כבסיס אבחוני קליני. עם זאת, בדיקת תאים עגולים מושפעת בקלות מתאי זרע מושחתים ותאי אפיתל בדרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה. יחד עם זאת, תהליך הגילוי של אלסטאז הוא מסובך יחסית, גוזל זמן ואיטי בדיווח על תוצאות, מה שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון דלקות בדרכי המין הגבריות (MGTI). יישמנו באופן חדשני את הבדיקה של לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע בסיוע מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) כקריטריון אבחון עבור לויקוציטוספרמיה, ופתרנו בהצלחה בעיות אלה. בדיקה זו דורשת רק תוספת של נוזל הפעולה המורכב מארבעה ריאגנטים לתוך הדגימה, ואת זמן התגובה הכולל בטמפרטורת החדר ניתן לשלוט בתוך 20-30 דקות. עם כתם הבא בדיקה מיקרוסקופית, ריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase בזרע ניתן להשיג בתוך סך של 60 דקות, אשר ניתן להשתמש בו כדי לאבחן אם דלקת של מערכת הרבייה הגברית קיים.

Introduction

אי פוריות התפתחה כבעיה עולמית של בריאות הציבור המשפיעה על כ -15% מהזוגות בגיל הפוריות שלהם. גורמים גבריים נתרמים על ידי כ -50% מכלל מקרי תת-פוריות, וכמעט 20% עד 30% ניתן לייחס אך ורק לגורמים גבריים ^1,2,3. זיהומים בדרכי המין הגבריים (MGTIs) מהווים את אחד הגורמים המשמעותיים לאי פוריות הגבר, ומהווים כ -15% מהמקרים ^4,5.

לרוב האנשים יש לויקוציטים בזרע שלהם, המהווים 13% מהתאים שאינם זרעונים, כאשר הפרופורציות השונות הן נויטרופילים 12%, מקרופאגים 0.9% ולימפוציטים 0.1%^6,7. על פי מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד של זרע אנושי (מהדורה 5), לויקוציטוספרמיה מוגדרת בדרך כלל כנוכחות של >1 × 10^{6 תאים} / מ"ל לויקוציטים בזרע⁸. מצב זה יכול להיגרם על ידי גורמים רבים כגון רעלים סביבתיים, שימוש בסמים, וריקוצלות, MGTI וכו ', כולם עלולים להוביל לעלייה חריגה בריכוז לויקוציטים בזרע⁹. לויקוציטים יכולים להעלות את רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בזרע, ולגרום לחמצון שומנים ולנזק חמצוני לחלבון ולדנ"א, מה שגורם לירידה בתנועתיות הזרעונים, לעלייה בהפרעות מורפולוגיות בזרעונים, לעלייה במדד פיצול הדנ"א של הזרעונים, לפגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים ואפילו להשפעות שליליות על התפתחות העובר^10,11.

כיום, אנדרולוגים בדרך כלל בוחרים לבחון תאים עגולים בזרע או אלסטאז בפלסמת הזרע בעת זיהוי דלקת בדרכי המין. עם זאת, לעתים קרובות מאתגר להבחין בין תאי זרע משופשפים לבין תאי אפיתל של דרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה⁶. שיטת הבדיקה האחרונה מסובכת יחסית וגוזלת זמן, עם דיווח תוצאות איטי, שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון MGTIs. האגודה האורולוגית האמריקאית (AUA) מציעה כי יש לבצע התמיינות נוספת בין לויקוציטים לתאים ממערכת איברי המין כאשר ריכוז התאים העגולים בניתוח זרע גדול מ- 1 × 10⁶ תאים / מ"ל¹². מעבדות אנדרולוגיה מסוימות משתמשות בציטומטריית זרימה¹³ או אנטיגן לויקוציטים (למשל, CD45) אימונוציטוכימיה¹⁴ כדי לבחון לויקוציטים. בעוד שיטות אלה מדויקות, הן יקרות וגוזלות זמן, מה שמקשה על יישום קליני בקנה מידה גדול, במיוחד במדינות מתפתחות.

פרוקסידז מופץ באופן נרחב בסוגים שונים של תאים וממלא תפקיד מכריע בעמידות לנזקי עקה חמצונית. Myeloperoxidase (MPO) הוא חבר בתת-משפחת הפרוקסידז המתבטא בדרך כלל בתאי מערכת החיסון. הוא מתבטא בצורה הגבוהה ביותר בגרגירים אזורופיליים^15,16 של נויטרופילים ומתבטא גם בלימפוציטים^17,18, מונוציטים ומקרופאגים¹⁹. ריכוז לויקוציטים, במיוחד נויטרופילים, בזרע ניתן להשיג על ידי בחינת תאים עגולים שהם חיוביים peroxidase ^7,20. כדי להפוך את תהליך הבדיקה של לויקוציטים בזרע לחסכוני, נוח ויעיל, הנדסנו מחדש את שיטת הבדיקה. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים תוך 60 דקות. שיטה חדשה זו מפחיתה את עלויות הבדיקה של המטופלים ואת זמן ההמתנה לקבלת תוצאות, מקלה על עומס העבודה של טכנאי המעבדה ומקצרת את תקופת ההמתנה לאבחון ולטיפול.

Protocol

מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן.

1. הכנת פתרון העבודה

1. אסוף את הריאגנטים הבאים החיוניים להכנת תמיסת העבודה - תמיסת מצע אורתו-טולוידין, תמיסת אמוניום כלורי רווי (NH₄Cl), תמיסת מלח דיסודיום 148 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (Na₂EDTA) ותמיסת מי חמצן 6% (v/v). הניחו אותם על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר (RT) יחד עם הכלים הדרושים, כגון פיפטות העברה (1000 μL, 200 μL, 10 μL) ומדפי מבחנה.
   התראה: קרא את גיליון נתוני הבטיחות (SDS) לפני הטיפול בריאגנטים שהוזכרו לעיל.
2. הכינו בקבוק מגיב חום אטום לאחסון והגנה על פתרון העבודה המוכן מפני חשיפה לאור.
3. העבירו את הריאגנטים לבקבוק מגיב חום אטום בהתאם לפרופורציות המפורטות להלן:
   1. נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 100 μL של תמיסת NH₄Cl לבקבוק מגיב חום אטום.
   2. החלף את קצה פיפטה והעבר 100 μL של תמיסת 148 mmol / L Na₂EDTA לבקבוק מגיב חום אטום באמצעות פיפטת העברה 200 μL שהוזכרה לעיל. לאחר מכן, לנשוף בעדינות על ידי pipetting ו homogenize ביסודיות את הפתרון.
   3. נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, להעביר 900 μL של תמיסת המצע ortho-toluidine לתוך בקבוק מגיב חום אטום, לנשוף בעדינות על ידי pipetting, והומוגני ביסודיות את התמיסה.
   4. נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-5 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 5 μL של תמיסת מי חמצן 6% (v/v) לבקבוק מגיב חום אטום.
4. נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. מחליפים את קצה הפיפטה, נושפים בעדינות על ידי פיפטינג, ומהומוגניים היטב את התמיסה בבקבוק מגיב חום אטום.
5. אחסן את פתרון העבודה המוכן לשימוש בבקבוק מגיב חום אטום ב- RT, הרחק מאור. פתרון העבודה הוא תגובתי במשך 24 שעות.
6. כל דגימת זרע דורשת 900 μL של פתרון העבודה. יש לוודא כי כמות פתרון העבודה המוכן בכל יום תואמת את מספר הדגימות הנבדקות מדי יום.

2. הכנת דגימת זרע

1. לפני איסוף דגימת הזרע, ודא שהמטופל נמנע משפיכה במשך 2 עד 7 ימים כנדרש במדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד זרע אנושי (מהדורה 5). ⁸. אוננות היא השיטה המועדפת לקבלת דגימות זרע. כדי לשפר את דיוק הבדיקה, להנחות את המטופל לאסוף את כל הזרע שנפלט.
2. הפעל את עמדת הטמפרטורה הקבועה וחמם עד 37 מעלות צלזיוס מראש, כך שהנזלה הבאה של דגימת הזרע תוכל להמשיך בצורה חלקה.
3. עם קבלת דגימת הזרע של המטופל, יש לתעד בקפדנות מידע מפורט, כולל קוד זיהוי, זמן איסוף, משך התנזרות ומידע רלוונטי אחר, על הקיר החיצוני של כלי הקיבול מבוסס הפולימר.
4. הניחו את כלי הקיבול על בסיס פולימר המאכלס את דגימת הזרע על מעמד הטמפרטורה הקבוע שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס, מה שמועיל להנזלת הזרע.
5. ציירו את דגימת הזרע לתוך פיפטה על בסיס פולימר והתבוננו במצב ההנזלה כל 5 דקות עד שדגימת הזרע נוזלית במלואה.
6. אם דגימת הזרע לא נוזלה במלואה תוך 30 דקות, אל תבצע את הבדיקה עדיין; המשיכו להמתין עוד 30 דקות. אם הזרע עדיין לא נוזלי במלואו לאחר 60 דקות, הוסף נפח שווה של תמיסת חיץ פוספט לדילול 1:1 והתסיס בעדינות כדי לקדם הנזלה.
7. לאחר תסיסה יסודית והומוגניזציה עקבית, שמור על דגימת הזרע הנוזלית במלואה להליכי הבדיקה הבאים.

3. צביעה של לויקוציטים חיוביים peroxidase וניתוח מדגם הזרע המקורי

1. לפני הדגימה, יש להשתמש בפיפט על בסיס פולימר כדי לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית בדגימת הזרע הנבדקת.
2. נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 100 μL של דגימת הזרע לתוך צינור צנטריפוגה.
3. נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 900 μL של פתרון העבודה הנ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה.
4. מכה חוזרת ונשנית על ידי pipetting הומוגניזציה ביסודיות את המגיב, אשר מורכב מדגם זרע פתרון עבודה, באמצעות פיפטה העברה 1000 μL.
5. מקם את צינור הצנטריפוגה במתלה מבחנה על שייקר דו-ממדי והפעל תסיסה רציפה ב-200 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
6. בזמן ההמתנה לתגובת הצביעה, נתח את דגימת הזרע באמצעות מערכת CASA כדי לקבוע את ריכוז הזרעונים בדגימת הזרע המקורית בכלי הקיבול מבוסס הפולימר.
   1. הפעל את מתג ההפעלה של מערכת CASA ולחץ פעמיים על סמל SCA SCOPE כדי לפתוח את תוכנת היישום.
   2. לפני הדגימה, יש לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית של דגימת הזרע המקורית שוב עם פיפטה על בסיס פולימר.
   3. נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, פיפטה עד 10 μL של דגימת הזרע המקורית, והכנס אותו לתא ספירת SCA. המתן 60 שניות עד שדגימת הזרע תפסיק להיסחף.
   4. מקם את תא ספירת ה- SCA על מחזיק הדגימה של מערכת CASA והגדר את פרטי המטופל בתיבת הדו-שיח של תוכנת היישום כדי להתכונן לבדיקה הרשמית.
   5. בדוק את דגימת הזרע המקורית בתא ספירת SCA עם מערכת CASA על ידי לחיצה על לחצן התחל ורשום את הנתונים הדרושים, כגון ריכוז הזרעונים.

4. תצפית על לויקוציטים חיוביים peroxidase ו spermatozoa

1. נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, ואז נשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג והומוגניזציה יסודית של המגיב, המורכב מדגימת זרע ותמיסת עבודה בצינור הצנטריפוגה שוב בסוף תהליך התגובה של 30 דקות.
2. נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החליפו את קצה הפיפטה, פיפטה במעלה 10 מיקרוליטר של המגיב שהוזכר לעיל, והכניסו אותה לתא ספירת הזרע. לבסוף, כסו את תא ספירת הזרע בכיסוי זכוכית ייעודי.
3. הניחו את תא ספירת הזרע על השלב המיקרוסקופי והפעילו את מתג ההפעלה של המיקרוסקופ האופטי באמצעות שתי עיניות 10x. לאחר מכן, המתן 60 שניות עד שהדגימה המגיבה תפסיק להיסחף.
4. העבר את הממיר המיקרוסקופי לעדשת האובייקט 10x במהלך זמן ההמתנה. לאחר מכן כוונן את ידית הכוונון הגסה ואת ידית הכוונון העדינה ברצף. לבסוף, התבוננו בזרעונים ובתאים עגולים תחת הגדלה של 10×10.
5. החלף את הממיר המיקרוסקופי לעדשה האובייקטיבית 40x לאחר קביעת שדה הראייה שיש לנתח, והתבונן בזרעונים ובלויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום תחת הגדלה של 10 × 40.
6. השתמש במערכת המונה האלקטרוני כדי לספור לפחות 200 זרעונים ואת מספר לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום בתוך השדות המתאימים.

5. חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase

1. חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase באמצעות הנוסחה הבאה:
   

תוצאות

בעת יישום ההליך שהוזכר לעיל, המגיב בצינור הצנטריפוגה מפגין לעתים קרובות מראה תת-שקוף ואטום, (איור 1). זיהוי צבע חום ברור חושף degranulation פוטנציאלי של לויקוציטים, אשר עלול לגרום כתמים נוזליים. כתוצאה מכך, תהליך הצביעה עלול להיכשל, ולכן יש צורך להכתים מחדש או לאסוף דגימת זרע חדשה ל...

Discussion

אורתו-טולוידין ומי חמצן הם בעלי תכונות רגישות לאור ויכולים להתפרק כאשר הם נחשפים לאור. כדי להבטיח את האפקטיביות של ריאגנטים הבדיקה, מומלץ לאחסן את נוזל העבודה מוכן במקום חשוך.

דגימות זרע מציגות באופן טבעי מאפיינים הטרוגניים. בתהליך ההכנה של דגימות זרע, שיפוט נכון של מצב ההנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE	Microptic S.L.	1222996; Model type: SCA-SCOPE-H	Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL)	Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD	2210009	Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL)	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20221101	Polymer-based pipette
Electronic counter	None	None	A multichannel counter
Electronic scales	Shanghai Liangping Instrument Co., LTD	D9008084	MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber	Makler	MQ30004	0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope	Olympus	3G41067201307	CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia C
Pipet tips(1 mL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	02923205	1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	00323961	1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	32822810	1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia A
SCA counting chamber	Microptic S.L.	102230608	10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20230701	Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table	Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD	MQ30004	MQ-300
Transfer pipette (10 µL)	Eppendoff	3121000.015
Transfer pipette (1000 µL)	Eppendoff	3121000.12
Transfer pipette (200 µL)	Eppendoff	3121000.082
Two-dimensional shaker	DragonLab	822000010000	VC5A002205