O Exame de Leucócitos Peroxidase Positivos no Sêmen

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo econômico e eficiente para o exame de leucócitos peroxidase positiva no sêmen. Com o auxílio de um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida em um total de 60 min, melhorando efetivamente a eficiência do laboratório de andrologia e dos andrologistas.

Resumo

A leucocitospermia pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides elevados, comprometimento da função acrossômica dos espermatozoides e até mesmo desenvolvimento embrionário afetado. É uma doença andrológica comum na prática clínica e uma das importantes causas de infertilidade masculina. Ao determinar se a inflamação do trato reprodutivo masculino existe, os andrologistas geralmente optam por examinar as células redondas ou a elastase plasmática seminal no sêmen como base de diagnóstico clínico. No entanto, o exame de células redondas é facilmente influenciado por células espermatogênicas descamadas e células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos. Ao mesmo tempo, o processo de detecção da elastase é relativamente complicado, demorado e lento na comunicação de resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como infecções do trato genital masculino (ITMG). Aplicamos de forma inovadora o exame de leucócitos peroxidase positiva em sêmen assistido por um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA) como critério diagnóstico para leucocitospermia, resolvendo com sucesso esses problemas. Este exame requer apenas a adição do fluido operacional composto por quatro reagentes na amostra, e o tempo total de reação à temperatura ambiente pode ser controlado dentro de 20-30 min. Com o esfregaço subsequente e o exame microscópico, a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida dentro de um total de 60 min, que pode ser usado para diagnosticar se a inflamação do trato reprodutor masculino existiu.

Introdução

A infertilidade emergiu como um problema de saúde pública global que afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva. Os fatores masculinos são responsáveis por cerca de 50% do total de casos de subfertilidade, e cerca de 20% a 30% podem ser atribuídos exclusivamente aos fatores masculinos ^1,2,3. As infecções do trato genital masculino (ITMG) constituem uma das causas significativas de infertilidade masculina, sendo responsáveis por cerca de 15% dos casos ^4,5.

A maioria dos indivíduos possui leucócitos no sêmen, constituindo 13% das células não espermáticas, sendo as proporções diferenciais neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% e linfócitos 0,1%^6,7. De acordo com o manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para exame e processamento de sêmen humano (5ª ed.), a leucocitospermia é usualmente definida como a presença de leucócitos >1 ×^{10 6} células/mL no sêmen8. Essa condição pode ser causada por inúmeros fatores, como toxinas ambientais, abuso de substâncias, varicoceles, MGTIs, etc., todos potencialmente levando a um aumento anormal da concentração leucocitária no sêmen⁹. Os leucócitos podem elevar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen, causando peroxidação lipídica e danos oxidativos à proteína e ao DNA, o que resulta em diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, aumento do índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides, comprometimento da função acrossomal dos espermatozoides e até mesmo impactos negativos no desenvolvimento embrionário^10,11.

Atualmente, os andrologistas geralmente optam por examinar células redondas no sêmen ou elastase no plasma seminal ao identificar a inflamação do trato genital. No entanto, muitas vezes é desafiador distinguir as células espermatogênicas esfaceladas das células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos⁶. Este último método de exame é relativamente complicado e demorado, com notificação lenta dos resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como os ITMG. A American Urological Association (AUA) sugere que uma maior diferenciação entre leucócitos e células esfaceladas do trato genital deve ser feita quando a concentração de células redondas na análise do sêmen for maior que 1 × 10⁶ células/mL¹². Alguns laboratórios de andrologia utilizam citometria de fluxo¹³ ou imunocitoquímica de antígenos leucocitários (por exemplo, CD45)¹⁴ para examinar leucócitos. Embora esses métodos sejam precisos, são caros e demorados, dificultando a implementação clínica em larga escala, especialmente em países em desenvolvimento.

A peroxidase é amplamente distribuída em vários tipos de células e desempenha um papel crucial na resistência ao dano do estresse oxidativo. A mieloperoxidase (MPO) é um membro da subfamília das peroxidases que é geralmente expressa em células imunes. É mais altamente expressa nos grânulos azurofílicos dos neutrófilos^15,16 e também é expressa em linfócitos^17,18, monócitos e macrófagos¹⁹. A concentração de leucócitos, especialmente neutrófilos, no sêmen pode ser obtida pelo exame de células redondas positivas para peroxidase ^7,20. Para tornar o processo de exame de leucócitos no sêmen econômico, conveniente e eficiente, reformulamos o método de exame. Assistida pelo sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos pode ser obtida em 60 min. Esse novo método reduz os custos dos exames dos pacientes e o tempo de espera para a obtenção dos resultados, alivia a carga de trabalho dos técnicos de laboratório e encurta o período de espera para diagnóstico e tratamento do médico.

Protocolo

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen.

1. Preparação da solução de trabalho

1. Reunir os seguintes reagentes essenciais para a preparação da solução de trabalho - solução de substrato de orto-toluidina, solução saturada de cloreto de amónio (NH₄Cl), solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético a 148 mmol/L (EDTA_{Na 2}) e solução de peróxido de hidrogénio a 6% (v/v). Coloque-os em uma bancada de laboratório à temperatura ambiente (RT) juntamente com as ferramentas necessárias, como pipetas de transferência (1000 μL, 200 μL, 10 μL) e racks de tubo de ensaio.
   CUIDADO: Leia a ficha de dados de segurança (SDS) antes de manusear os reagentes acima mencionados.
2. Prepare um frasco de reagente marrom opaco para armazenar e proteger a solução de trabalho preparada da exposição à luz.
3. Transfira os reagentes para o frasco de reagente marrom opaco de acordo com as proporções especificadas abaixo:
   1. Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Em seguida, transfira 100 μL da solução NH₄Cl para o frasco de reagente marrom opaco.
   2. Substitua a ponta da pipeta e transfira 100 μL da solução de EDTA de 148 mmol/L Na₂para o frasco de reagente marrom opaco usando a pipeta de transferência de 200 μL mencionada acima. Em seguida, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.
   3. Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Em seguida, transfira 900 μL da solução do substrato orto-toluidina para o frasco de reagente marrom opaco, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.
   4. Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 5 μL girando o botão. Em seguida, transfira 5 μL da solução de peróxido de hidrogênio a 6% (v/v) para o frasco de reagente marrom opaco.
4. Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução no frasco de reagente marrom opaco.
5. Armazene a solução de trabalho pronta para utilização no frasco de reagente marrom opaco em RT, longe da luz. A solução de trabalho é reativa por 24 horas.
6. Cada amostra de sémen requer 900 μL da solução de trabalho. Assegurar que a quantidade da solução de trabalho preparada diariamente corresponde ao número de amostras examinadas diariamente.

2. Preparação da amostra de sémen

1. Antes de coletar a amostra de sêmen, certifique-se de que o paciente tenha se abstido da ejaculação por 2 a 7 dias, conforme exigido pelo manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para examinar e processar o sêmen humano (5ª ed.) ⁸. A masturbação é o método preferido para a obtenção de amostras de sêmen. Para melhorar a precisão do exame, instrua o paciente a coletar todo o sêmen ejaculado.
2. Ligue o suporte de temperatura constante e aqueça até 37 °C com antecedência para que a liquefação subsequente da amostra de sêmen possa prosseguir sem problemas.
3. Após o recebimento da amostra de sêmen do paciente, registre meticulosamente informações detalhadas, incluindo código de identificação, tempo de coleta, duração da abstinência e outras informações pertinentes, na parede externa do recipiente à base de polímero.
4. Coloque o recipiente à base de polímero que abriga a amostra de sêmen no suporte de temperatura constante pré-aquecido a 37 °C, o que é benéfico para a liquefação do sêmen.
5. Aspirar a amostra de sémen para uma pipeta à base de polímero e observar o estado de liquefação a cada 5 minutos até que a amostra de sémen esteja totalmente liquefeito.
6. Se a amostra de sémen não tiver sido totalmente liquefeita no prazo de 30 minutos, não realize ainda o exame; Continue a esperar por mais 30 min. Se o sémen ainda não estiver totalmente liquefeito após 60 minutos, adicionar um volume igual de solução tampão fosfato para uma diluição de 1:1 e agitar suavemente para promover a liquefação.
7. Após agitação completa e homogeneização consistente, retenha a amostra de sêmen totalmente liquefeito para os procedimentos de exame subsequentes.

3. Coloração dos leucócitos peroxidase positiva e análise da amostra de sêmen original

1. Antes da amostragem, utilize uma pipeta à base de polímero para soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen sob exame.
2. Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 100 μL da amostra de sémen para um tubo de centrifugação.
3. Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 900 μL da solução de trabalho acima mencionada para o tubo da centrífuga.
4. Sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste na amostra de sêmen e na solução de trabalho, usando a pipeta de transferência de 1000 μL.
5. Posicione o tubo da centrífuga em um rack de tubo de ensaio sobre um agitador bidimensional e submeta-o a agitação contínua a 200 rpm por 30 min no RT.
6. Enquanto aguarda a reação de coloração, analise a amostra de sêmen utilizando o sistema CASA para determinar a concentração de espermatozoides na amostra de sêmen original no recipiente à base de polímero.
   1. Ligue o interruptor de alimentação do sistema CASA e clique duas vezes no ícone SCA SCOPE para abrir o software do aplicativo.
   2. Antes da amostragem, soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen original novamente com uma pipeta à base de polímero.
   3. Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar 10 μL da amostra de sêmen original e colocá-la na câmara de contagem SCA. Aguarde 60 s para que a amostra de sêmen pare de derivar.
   4. Posicione a câmara de contagem da SCA no porta-amostras do sistema CASA e defina as informações do paciente na caixa de diálogo do software aplicativo para se preparar para o exame formal.
   5. Examine a amostra de sêmen original na câmara de contagem da SCA com o sistema CASA clicando no botão Iniciar e registre os dados necessários, como a concentração de espermatozoides.

4. Observação dos leucócitos e espermatozoides positivos para peroxidase

1. Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, depois sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste em amostra de sêmen e solução de trabalho no tubo da centrífuga novamente no final do processo de reação de 30 minutos.
2. Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar até 10 μL do reagente mencionado acima e colocá-lo na câmara de contagem de espermatozoides. Finalmente, cubra a câmara de contagem de espermatozoides com uma tampa de vidro dedicada.
3. Coloque a câmara de contagem de espermatozoides no palco microscópico e ligue o interruptor de energia do microscópio óptico com duas oculares de 10x. Em seguida, aguarde 60 s para que a amostra de reagente pare de derivar.
4. Troque o conversor microscópico para a lente objetiva de 10x durante o tempo de espera. Em seguida, ajuste o botão de ajuste grosso e o botão de ajuste fino em sequência. Finalmente, observe os espermatozoides e as células redondas sob um aumento de 10×10.
5. Trocar o conversor microscópico para a objetiva de 40x após determinar o campo de visão a ser analisado e observar os espermatozoides e leucócitos marrom peroxidase positiva sob um aumento de 10 × 40.
6. Utilize o sistema de contador eletrônico para contar pelo menos 200 espermatozoides e o número de leucócitos positivos para peroxidase marrom dentro dos campos correspondentes.

5. Cálculo da concentração de leucócitos peroxidase positiva

1. Calcular a concentração de leucócitos positivos para peroxidase utilizando a seguinte fórmula:
   

Resultados

Ao implementar o procedimento supracitado, o reagente no tubo da centrífuga frequentemente manifesta aspecto subtranslúcido e opalescente (Figura 1). A detecção de uma cor obviamente marrom revela potencial degranulação de leucócitos, o que pode resultar em coloração líquida. Consequentemente, o processo de coloração pode falhar, tornando necessário recolorir ou coletar uma nova amostra de sêmen para novo teste²¹.

Os leucócit...

Discussão

A orto-toluidina e o peróxido de hidrogênio têm propriedades fotossensíveis e podem se decompor quando expostos à luz. Para garantir a eficácia dos reagentes de teste, recomenda-se que o fluido de trabalho preparado seja armazenado em um local escuro.

As amostras de sêmen naturalmente exibem características heterogêneas. No processo de preparação de amostras de sêmen, julgar corretamente o estado de liquefação do sêmen e homogeneizar completamente as amostras de sêmen antes de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE	Microptic S.L.	1222996; Model type: SCA-SCOPE-H	Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL)	Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD	2210009	Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL)	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20221101	Polymer-based pipette
Electronic counter	None	None	A multichannel counter
Electronic scales	Shanghai Liangping Instrument Co., LTD	D9008084	MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber	Makler	MQ30004	0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope	Olympus	3G41067201307	CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia C
Pipet tips(1 mL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	02923205	1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	00323961	1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	32822810	1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia A
SCA counting chamber	Microptic S.L.	102230608	10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20230701	Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table	Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD	MQ30004	MQ-300
Transfer pipette (10 µL)	Eppendoff	3121000.015
Transfer pipette (1000 µL)	Eppendoff	3121000.12
Transfer pipette (200 µL)	Eppendoff	3121000.082
Two-dimensional shaker	DragonLab	822000010000	VC5A002205