通过腰椎池注射在幼年大鼠中鞘内载体给药

摘要

描述了一种外科手术，用于向幼年大鼠的腰椎池进行注射。这种方法已被用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计这种方法可用于多种疗法，包括细胞和药物。

摘要

基因治疗是一项强大的技术，可以将新基因传递给患者以治疗疾病，无论是引入功能基因、灭活有毒基因，还是提供其产物可以调节疾病生物学的基因。治疗载体的给药方法可以采取多种形式，从用于全身给药的静脉输注到直接注射到靶组织中。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。针对整个中枢神经系统的侵入性最小的方法涉及注射脑脊液 （CSF），使治疗药物能够到达中枢神经系统的大部分。将载体输送到脑脊液的最安全方法是腰椎鞘内注射，将针头引入脊髓的腰椎池。这种技术，也称为腰椎穿刺，已广泛用于新生儿和成年啮齿动物以及大型动物模型。虽然该技术在物种和发育阶段之间是相似的，但鞘内空间周围组织的大小、结构和弹性的细微差异需要在方法中进行调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关血清型 9 载体的方法。在这里，将 25-35 μL 载体注射到腰椎池中，并使用绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因评估每次注射产生的转导谱。讨论了这种方法的好处和挑战。

引言

近年来，随着 FDA 批准治疗脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、因子 IX 血友病、癌症等，病毒介导的基因疗法的前景终于得以实现 1,2,3,4。目前有无数其他疗法正在开发中。基因疗法旨在将治疗基因传递到患者的细胞中。这种新基因的产物可以替代缺陷内源性基因缺失的活性，抑制有毒基因，杀死癌细胞，或提供一些其他有益功能。

对于影响中枢神经系统 （CNS） 的疾病，将基因治疗载体直接递送至靶组织通常是可取的。非全身性方法有两个好处：它们最大限度地减少了可能由外周转导引起的脱靶副作用，并且它们大大减少了在靶组织中达到足够转导水平所需的载体量⁵。

有多种方法可以将基因治疗载体输送到中枢神经系统。脑实质内注射，即将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于输送到指定区域。然而，对于许多疾病，需要中枢神经系统的广泛转导。这可以通过向脑脊液 （CSF）⁵ 输送载体来实现，脑脊液是流入和流入大脑和脊髓及其周围的液体。有三种主要方法可以将载体输送到 CSF。最具侵入性的方法是脑室内分娩，它涉及在颅骨上....

研究方案

这项研究得到了埃默里大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用Sprague-Dawley大鼠（28-30日龄，质量范围约为90-135g，雄性和雌性）。

1. 载体的制备

1. 在程序开始时在冰上解冻 AAV9 载体（参见 材料表）。
2. 在台式离心机中短暂离心含有载体的微量离心管，以确保所有液体都在管的底部。
3. 轻轻轻弹微量离心管，确保溶液充分混合。

2. 回收笼的准备

1. 将一个干净的笼子放在电热毯上（参见 材料表），使只有一半的笼子与毯子接触。
2. 将毯子的温度设置为 ~37 °C。

3.手术平台的准备

1. 在微波炉或水浴中将等温垫（参见 材料表）加热至39°C，使内容物变成液体。
2. 将等温垫放在手术平台上，并用干净的吸收性台垫覆盖。

4. 动物准备

1. 在透明盒子中用异氟醚麻醉大鼠（....

讨论

多种疾病会影响中枢神经系统。对于那些本质上是隐性和单基因的，如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体提供相关基因的功能拷贝是一种有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障 （BBB） 排除了大多数静脉注射的基因治疗载体¹¹。那些可以穿过 BBB 的药物，例如 AAV9，必须以高剂量给药，以克服由于外周转导引起的载体丢失¹²。年龄也是一个障碍。对各种 AAV 血清型的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection