通过腰椎池注射在幼年大鼠中鞘内载体给药

摘要

描述了一种外科手术，用于向幼年大鼠的腰椎池进行注射。这种方法已被用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计这种方法可用于多种疗法，包括细胞和药物。

摘要

基因治疗是一项强大的技术，可以将新基因传递给患者以治疗疾病，无论是引入功能基因、灭活有毒基因，还是提供其产物可以调节疾病生物学的基因。治疗载体的给药方法可以采取多种形式，从用于全身给药的静脉输注到直接注射到靶组织中。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。针对整个中枢神经系统的侵入性最小的方法涉及注射脑脊液 （CSF），使治疗药物能够到达中枢神经系统的大部分。将载体输送到脑脊液的最安全方法是腰椎鞘内注射，将针头引入脊髓的腰椎池。这种技术，也称为腰椎穿刺，已广泛用于新生儿和成年啮齿动物以及大型动物模型。虽然该技术在物种和发育阶段之间是相似的，但鞘内空间周围组织的大小、结构和弹性的细微差异需要在方法中进行调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关血清型 9 载体的方法。在这里，将 25-35 μL 载体注射到腰椎池中，并使用绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因评估每次注射产生的转导谱。讨论了这种方法的好处和挑战。

引言

近年来，随着 FDA 批准治疗脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、因子 IX 血友病、癌症等，病毒介导的基因疗法的前景终于得以实现 1,2,3,4。目前有无数其他疗法正在开发中。基因疗法旨在将治疗基因传递到患者的细胞中。这种新基因的产物可以替代缺陷内源性基因缺失的活性，抑制有毒基因，杀死癌细胞，或提供一些其他有益功能。

对于影响中枢神经系统 （CNS） 的疾病，将基因治疗载体直接递送至靶组织通常是可取的。非全身性方法有两个好处：它们最大限度地减少了可能由外周转导引起的脱靶副作用，并且它们大大减少了在靶组织中达到足够转导水平所需的载体量⁵。

有多种方法可以将基因治疗载体输送到中枢神经系统。脑实质内注射，即将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于输送到指定区域。然而，对于许多疾病，需要中枢神经系统的广泛转导。这可以通过向脑脊液 （CSF）⁵ 输送载体来实现，脑脊液是流入和流入大脑和脊髓及其周围的液体。有三种主要方法可以将载体输送到 CSF。最具侵入性的方法是脑室内分娩，它涉及在颅骨上钻一个毛刺孔，然后将针头穿过大脑进入侧脑室。这会产生整个大脑的转导。然而，该手术可能导致颅内出血，并且该方法通常仅产生有限的脊髓转导⁶。注射到颅底的脑池大池中侵入性较小，但有损伤脑干的风险。虽然在动物研究中经常使用⁵，但注射到大池中在临床上不再常规使用⁷。腰椎穿刺是进入脑脊液的侵入性最小的方法。这包括在两个腰椎之间放置一根针并插入腰椎池。

用于载体输送的腰椎穿刺在成年大鼠和小鼠以及新生小鼠中常规进行 ^8,9。这项研究的作者最近对幼年大鼠（28-30 日龄）进行了腰椎穿刺，以提供腺相关病毒血清型 9 （AAV9） 载体。在成年大鼠中，将新生儿腰椎穿刺针垂直放置在 L3 和 L4 椎骨之间⁹。正确放置会导致尾部甩动和脑脊液向上流入针头储液器。然而，在幼年大鼠中，这些读数都无法实现。然后，作者尝试使用以 L5 和 L6¹⁰ 之间的角度插入的 27 G 胰岛素注射器来适应成年小鼠程序。在通常小于P28大鼠的成年小鼠中，这不会产生尾巴甩动，但是通过注射剂的回流可以明显看出不正确的针头放置。然而，在幼年大鼠中，这种方法一致地导致注射剂是硬膜外给药的，这可能是由于成年小鼠和幼年大鼠之间脊髓周围组织层的弹性不同所致。接下来评估导管入路。具体来说，通过腰椎池硬脑膜的切口引入导管，直至胸椎中脊髓;然而，这种方法导致注射液在分娩过程中大量回流出切口部位。尝试使用导针经皮将导管插入鞘内腔也未成功。由于椎板间宽度较窄，导管可能会撞击喙部椎板而无法前进。

在这里，描述了一种 通过 在幼年大鼠中通过腰椎穿刺实现成功且可重复的溶液递送的方法。这种方法可用于病毒载体，也可能用于细胞、药物和其他疗法。

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研究方案

这项研究得到了埃默里大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用Sprague-Dawley大鼠（28-30日龄，质量范围约为90-135g，雄性和雌性）。

1. 载体的制备

1. 在程序开始时在冰上解冻 AAV9 载体（参见 材料表）。
2. 在台式离心机中短暂离心含有载体的微量离心管，以确保所有液体都在管的底部。
3. 轻轻轻弹微量离心管，确保溶液充分混合。

2. 回收笼的准备

1. 将一个干净的笼子放在电热毯上（参见 材料表），使只有一半的笼子与毯子接触。
2. 将毯子的温度设置为 ~37 °C。

3.手术平台的准备

1. 在微波炉或水浴中将等温垫（参见 材料表）加热至39°C，使内容物变成液体。
2. 将等温垫放在手术平台上，并用干净的吸收性台垫覆盖。

4. 动物准备

1. 在透明盒子中用异氟醚麻醉大鼠（遵循机构批准的方案）。使用 5% 异氟醚开始麻醉诱导，每分钟降低 1% 直至达到 2%。将动物保持在 2% 再保持 3 分钟。
2. 将装有动物的盒子移至通风橱中，然后打开盒子。
   注意：这限制了外科医生对麻醉剂的暴露。
3. 使用电动理发器从动物背部去除毛发。
   注意：或者，可以使用脱毛膏或手动剃须刀和剃须膏。
4. 将动物放在手术平台上，其鼻子位于麻醉鼻锥中。
   注意：当毛皮从手术部位取下时，动物可能会开始恢复意识。如果发生这种情况，请按照上述方式再次麻醉。
5. 在每只眼睛上涂抹润滑眼膏，以防止在手术过程中角膜干燥。
6. 使用聚维酮碘和异丙醇湿巾的三次交替应用对手术区域进行消毒。
7. 皮下注射镇痛药。
   注：丁丙诺啡通常以0.01-0.05mg / kg的剂量使用，每12小时给药一次。或者，该药物的缓释形式可以以 1 mg/kg 给药一次，以提供 72 小时的充分疼痛控制。请咨询该机构的 IACUC 以获取有关疼痛管理的指南。
8. 将 100 μL 1% 利多卡因皮下注射至 L2 至 L6 棘突上方，以提供局部麻醉。
9. 将一卷纸巾或直径为 1.5 厘米的管子放在动物下方，刚好靠近臀部。这有助于弯曲脊柱，从而更容易将针头插入两个薄片之间。
10. 在动物身上放置一个开窗帘（见 材料表），将开窗放在腰椎上方的中心。

5.暴露腰椎

1. 通过捏住动物的每一只爪子并寻找是否存在戒断反应来确认麻醉的深度。
2. 使用 #11 手术刀刀片，在从 L2 到 L6 中线的皮肤上创建一个约 3 厘米长的切口。
3. 通过在肌肉和皮肤之间插入一把无菌弯曲的手术剪刀，然后打开尖端，使皮肤从肌肉上松开。
4. 移除覆盖 L2-L5 棘突的筋膜。

6. 注射器的装载

1. 将 25-35 μL 载体（达到所需剂量）移液到无菌微量离心管的盖子中。
2. 将整个体积吸入胰岛素注射器中。
   注意：在此过程中注意不要吸入空气。

7. 执行注射

1. 识别 L5 和 L4 棘突。
   注意： L6 直接位于两个髂嵴之间，其棘突应该很容易通过用钝器探测来识别。然后，可以将仪器轻轻地从后面滑行，以找到 L5 和 L4 过程的边界。
2. 将一只手轻轻放在动物的尾巴和一条腿上。用手指稳定注射器。
3. 将注射器的针头放置在L5棘突的左侧，并与其尾端对齐。放置注射器，使其偏离中线约 30°，距工作台平面向上 30°。
   注意：使用手术显微镜更好地识别标志并定位针尖可能会有所帮助。
4. 将注射器针头向前推进约 8 毫米，越过 L5 椎板的顶部，然后在 L4 椎板下方进入腰椎池，直到骨头被击中。正确的放置将导致腿和/或尾巴抽搐，而放在腿/尾巴上的拇指可以看到或感觉到。如果没有抽搐，请取下针头并从左侧尝试该过程。如果仍然没有抽搐，请根据需要在 L4/L3 和 L3/L2 之间重复该过程。
5. 缓慢按下柱塞约 5 秒。
   注意：注射过程中腿部或尾巴可能会抽搐。
6. 完全按下柱塞后，将注射器保持在原位约 30 秒，以使压力平衡并最大限度地减少针头拔出时注射液的回流。
7. 慢慢取下针头。

8. 切口闭合

1. 近似切口的边缘。
2. 从伤口的一端开始，使用 4-0 缝合线（参见 材料表）或手术钉闭合切口。

9. 恢复和监控

1. 将动物放入预热的笼子中。
2. 至少每 15 分钟检查一次动物，直到它完全可以走动。
   注意：这应该需要 15 分钟到 45 分钟。
3. 在接下来的三天里，至少每天进行一次健康检查。在手术后的前 2 天或根据 IACUC 的要求提供镇痛药。
4. 手术后一周，取下缝合线或订书钉。

10. 后续程序

注意：为了确定注射技术的准确性，如上所述注射台盼蓝染料，然后立即对动物实施安乐死（遵循机构批准的方案）并进行椎板切除术以可视化结果。

1. 当动物仍处于麻醉状态时，通过 腹膜内 注射以 150 mg/kg 的剂量给予致死剂量的戊巴比妥对其实施安乐死。
2. 一旦呼吸和心脏活动停止，打开胸腔以确保死亡。将手术切口从背部延伸到颈部。
3. 在棘突两侧平行于脊柱的肌肉中做一个 4 厘米长的切口，尽可能靠近脊柱突。
4. 使用细镊子或剪刀，从棘突之间取出肌肉。
5. 使用 rongeur 从 L6 向下胸椎移除棘突（参见 材料表）。避免扭转动作，因为这可能会损坏 rongeurs。
6. 将 rongeur 的下尖端插入 L5 椎板下方，并通过从中“咬”几下去除覆盖在脊髓上的骨头。
   注意：向后拉 L6 棘突可以更容易地插入 rongeur 的尖端。必须注意防止对脊髓造成损害。
7. 继续将椎板切除术向喙部扩张至少四个椎板。检查薄片的内表面是否有染料迹象，这可能表明注射失败。

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结果

为了确定注射技术的准确性，使用染料台盼蓝作为治疗剂的替代物。这种染料很容易与蛋白质结合，因此它通常保持在注射到的结构内。这意味着染料可能无法准确预测治疗剂的注射后分布;它只是用来揭示注射的准确性。当成功引入腰椎池时，台盼蓝会与硬脑膜结合，染上脊髓周边的蓝色。然而，当针头无法穿透硬脑膜时，染料最终会进入硬膜外腔。硬脑膜和周围组织（骨骼表面以及连接椎板的...

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讨论

多种疾病会影响中枢神经系统。对于那些本质上是隐性和单基因的，如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体提供相关基因的功能拷贝是一种有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障 （BBB） 排除了大多数静脉注射的基因治疗载体¹¹。那些可以穿过 BBB 的药物，例如 AAV9，必须以高剂量给药，以克服由于外周转导引起的载体丢失¹²。年龄也是一个障碍。对各种 AAV 血清型的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection