Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Resumo

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Resumo

A terapia gênica é uma tecnologia poderosa para fornecer novos genes a um paciente para o tratamento da doença, seja para introduzir um gene funcional, inativar um gene tóxico ou fornecer um gene cujo produto pode modular a biologia da doença. O método de entrega do vetor terapêutico pode assumir várias formas, desde a infusão intravenosa para administração sistêmica até a injeção direta no tecido-alvo. Para distúrbios neurodegenerativos, muitas vezes é desejável inclinar a transdução para o cérebro e/ou medula espinhal. A abordagem menos invasiva para atingir todo o sistema nervoso central envolve a injeção no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que a terapêutica atinja uma grande fração do sistema nervoso central. A abordagem mais segura para administrar um vetor no LCR é a injeção intratecal lombar, onde uma agulha é introduzida na cisterna lombar da medula espinhal. Essa técnica, também conhecida como punção lombar, tem sido amplamente utilizada em roedores neonatais e adultos e em modelos animais de grande porte. Embora a técnica seja semelhante entre espécies e estágios de desenvolvimento, diferenças sutis no tamanho, estrutura e elasticidade dos tecidos ao redor do espaço intratecal requerem acomodações na abordagem. Este artigo descreve um método para realizar punção lombar em ratos juvenis para fornecer um vetor adeno-associado do sorotipo 9. Aqui, 25-35 μL de vetor foram injetados na cisterna lombar, e um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para avaliar o perfil de transdução resultante de cada injeção. Os benefícios e desafios dessa abordagem são discutidos.

Introdução

A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outr....

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC). Ratos Sprague-Dawley (28-30 dias de idade, massa na faixa de cerca de 90-135 g, machos e fêmeas) foram utilizados no presente estudo.

1. Preparação do vetor

1. Descongele o vetor AAV9 (consulte a Tabela de Materiais) no gelo no início do procedimento.
2. Centrifugue brevemente o tubo de microcentrífuga contendo o vetor em uma centrífuga de mesa para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo.
3. Agite suavemente o tubo da microcentrífuga para garantir que a solução est....

Discussão

Uma grande variedade de doenças afeta o SNC. Fornecer uma cópia funcional do gene relevante por meio de um vetor viral é uma estratégia de tratamento atraente para aqueles que são recessivos e monogênicos por natureza, como atrofia muscular espinhal. No entanto, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui a maioria dos vetores de terapia gênica administrados por via intravenosa¹¹. Aqueles que podem cruzar a BHE, como AAV9, devem ser administrados em altas doses para superar a perda vetorial d.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection