Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Resumen

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Resumen

La terapia génica es una poderosa tecnología para entregar nuevos genes a un paciente para el tratamiento de una enfermedad, ya sea para introducir un gen funcional, inactivar un gen tóxico o proporcionar un gen cuyo producto pueda modular la biología de la enfermedad. El método de administración del vector terapéutico puede adoptar muchas formas, desde la infusión intravenosa para la administración sistémica hasta la inyección directa en el tejido diana. En el caso de los trastornos neurodegenerativos, a menudo es deseable sesgar la transducción hacia el cerebro y/o la médula espinal. El enfoque menos invasivo para dirigirse a todo el sistema nervioso central implica la inyección en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite que la terapia llegue a una gran fracción del sistema nervioso central. El método más seguro para inyectar un vector en el líquido cefalorraquídeo es la inyección intratecal lumbar, en la que se introduce una aguja en la cisterna lumbar de la médula espinal. Esta técnica, también conocida como punción lumbar, ha sido ampliamente utilizada en roedores neonatos y adultos y en modelos animales grandes. Si bien la técnica es similar en todas las especies y etapas de desarrollo, las diferencias sutiles en el tamaño, la estructura y la elasticidad de los tejidos que rodean el espacio intratecal requieren adaptaciones en el enfoque. En este artículo se describe un método para realizar la punción lumbar en ratas juveniles para administrar un vector adenoasociado al serotipo 9. Aquí, se inyectaron 25-35 μL de vector en la cisterna lumbar y se utilizó un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar el perfil de transducción resultante de cada inyección. Se discuten los beneficios y desafíos de este enfoque.

Introducción

La promesa de las terapias génicas mediadas por virus finalmente se ha hecho realidad en los últimos años con la aprobación de la FDA de tratamientos para la atrofia muscular espinal, la distrofia de retina, la hemofilia del factor IX, el cáncer y más 1,2,3,4. Un sinnúmero de otras terapias están actualmente en desarrollo. La terapia génica tiene como objetivo administrar un gen terapéutico a las células de un paciente. Los productos de este nuevo gen pueden reemplazar la actividad faltante de un gen endógeno deficiente, inhibir un gen tóxico, matar células cancerosas o proporcionar alguna otra función beneficiosa.

En el caso de las enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), suele ser deseable administrar el vector de terapia génica directamente al tejido diana. Los enfoques no sistémicos proporcionan dos beneficios: minimizan los efectos secundarios fuera del objetivo que pueden ser causados por la transducción periférica y reducen en gran medida la cantidad de vector necesaria para lograr niveles adecuados de transducción en el tejido objetivo⁵.

Existe una variedad de enfoques para administrar vectores de terapia génica al SNC. La inyección intraparenquimatosa, la inyección de un vector directamente en la médula espinal o el tejido cerebral, se puede utilizar para la administración a una región definida. Sin embargo, para muchas enfermedades, se desea una transducción amplia del SNC. Esto se puede lograr mediante la entrega de un vector al líquido cefalorraquídeo (LCR)⁵, el líquido que fluye dentro y alrededor del cerebro y la médula espinal. Hay tres formas principales de entregar vectores al CSF. El enfoque más invasivo es la administración intracerebroventricular, que consiste en perforar un orificio a través del cráneo y hacer avanzar una aguja a través del cerebro hasta los ventrículos laterales. Esto produce la transducción a través del cerebro. Sin embargo, el procedimiento puede causar hemorragia intracraneal, y el abordaje generalmente produce solo una transducción limitada de la médula espinal⁶. La inyección en la cisterna magna en la base del cráneo es menos invasiva, pero conlleva el riesgo de daño al tronco encefálico. Si bien se usa a menudo en la investigación con animales⁵, la inyección en la cisterna magna ya no se usa de manera rutinaria en la clínica⁷. La punción lumbar es el abordaje menos invasivo para acceder al líquido cefalorraquídeo. Consiste en colocar una aguja entre dos vértebras lumbares y dentro de la cisterna lumbar.

La punción lumbar para el parto del vector se realiza de forma rutinaria en ratas y ratones adultos y en ratones neonatos ^8,9. Los autores de este estudio realizaron recientemente punciones lumbares en ratas jóvenes (28-30 días de edad) para administrar vectores del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En ratas adultas, se colocó una aguja de punción lumbar neonatal verticalmente entre las vértebras L3 y L4⁹. La colocación adecuada da como resultado un movimiento de la cola y el líquido cefalorraquídeo que fluye hacia el depósito de la aguja. Sin embargo, en ratas jóvenes, no se pudo lograr ninguna de estas lecturas. A continuación, los autores intentaron adaptar un procedimiento en ratones adultos utilizando una jeringa de insulina de 27 G insertada en un ángulo entre L5 y L6¹⁰. En ratones adultos, que suelen ser más pequeños que las ratas P28, esto no produce un movimiento de la cola, pero la colocación incorrecta de la aguja es evidente por el reflujo de la inyección. Sin embargo, en ratas jóvenes, este enfoque condujo uniformemente a que la inyección se administrara por vía epidural, probablemente como resultado de la diferente elasticidad entre ratones adultos y ratas juveniles de las capas de tejido que rodean la médula espinal. A continuación, se evaluaron los abordajes de los catéteres. En concreto, se introdujo un catéter a través de una incisión en la duramadre de la cisterna lumbar y hasta la médula espinal torácica media; Sin embargo, este enfoque condujo a un reflujo sustancial del inyectado fuera del sitio de la incisión durante el parto. Los intentos de colocar el catéter en el espacio intratecal por vía percutánea utilizando una aguja guía tampoco tuvieron éxito. Debido a la estrechez del ancho interlaminar, es probable que el catéter golpee la lámina rostral y no avance.

Aquí, se describe un método para lograr una administración exitosa y reproducible de la solución a través de una punción lumbar en la rata juvenil. Este enfoque se puede utilizar para vectores virales y, probablemente, también para células, productos farmacéuticos y otras terapias.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (28-30 días de edad, masa en el rango de aproximadamente 90-135 g, machos y hembras).

1. Preparación del vector

1. Descongele el vector AAV9 (consulte la Tabla de materiales) en hielo al comienzo del procedimiento.
2. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrífuga que contiene el vector en una centrífuga de mesa para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo.
3. Agite suavemente el tubo de la microcentrífuga para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.

2. Preparación de la jaula de recuperación

1. Coloque una jaula limpia sobre una manta eléctrica (consulte la Tabla de materiales) de modo que solo la mitad de la jaula esté en contacto con la manta.
2. Ajuste la temperatura de la manta a ~37 °C.

3. Preparación de la plataforma quirúrgica

1. Calentar una almohadilla isotérmica (ver Tabla de Materiales) a 39 °C en un microondas o en un baño de agua para que el contenido se vuelva líquido.
2. Coloque la almohadilla isotérmica en la plataforma quirúrgica y cúbrala con una almohadilla de banco absorbente limpia.

4. Preparación animal

1. Anestesiar a las ratas con isoflurano en una caja transparente (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Iniciar la inducción anestésica con isoflurano al 5% e ir disminuyendo un 1% por minuto hasta llegar al 2%. Sostenga al animal al 2% durante 3 minutos más.
2. Mueva la caja que sujeta al animal a una campana extractora y abra la caja.
   NOTA: Esto limita la exposición del cirujano al anestésico.
3. Retire el pelo del lomo del animal con una cortadora de pelo eléctrica.
   NOTA: Alternativamente, se puede utilizar una crema depilatoria o una maquinilla de afeitar manual y crema de afeitar.
4. Coloque al animal en la plataforma quirúrgica con su hocico en el cono de la nariz de anestesia.
   NOTA: El animal puede comenzar a recuperar la conciencia mientras se retira el pelaje del sitio quirúrgico. Si esto sucede, anestesia nuevamente como se describió anteriormente.
5. Aplique ungüento lubricante para los ojos en cada ojo para evitar que las córneas se sequen durante el procedimiento.
6. Desinfecte el área quirúrgica con tres aplicaciones alternas de toallitas de povidona yodada e isopropanol.
7. Inyecte los analgésicos por vía subcutánea.
   NOTA: La buprenorfina se utiliza generalmente en una dosis de 0,01-0,05 mg/kg, administrada cada 12 h. Alternativamente, se puede administrar una forma de liberación lenta de este fármaco una vez a 1 mg/kg para proporcionar un control adecuado del dolor durante 72 h. Consulte con la IACUC de la institución para conocer sus pautas con respecto al manejo del dolor.
8. Inyectar 100 μL de lidocaína al 1% por vía subcutánea por encima de las apófisis espinosas L2 a L6 para proporcionar anestesia local.
9. Coloque un rollo de papel toalla o un tubo de 1,5 cm de diámetro debajo del animal, justo rostral hasta las caderas. Esto ayuda a flexionar la columna vertebral, lo que facilita la inserción de la aguja entre las dos láminas.
10. Coloque una cortina fenestrada (ver Tabla de Materiales) sobre el animal, centrando la fenestración sobre la columna lumbar.

5. Exposición de la columna lumbar

1. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando cada una de las patas del animal y buscando la ausencia de una respuesta de retirada.
2. Con una hoja de bisturí #11, haga una incisión de aproximadamente 3 cm de largo en la piel a lo largo de la línea media de L2 a L6.
3. Afloje la piel del músculo insertando un par de tijeras quirúrgicas curvas estériles entre el músculo y la piel y luego abriendo las puntas.
4. Retire la fascia que cubre las apófisis espinosas L2-L5.

6. Carga de la jeringa

1. Pipetear 25-35 μL del vector (para lograr la dosis deseada) en la tapa de un tubo de microcentrífuga estéril.
2. Introduzca todo el volumen en la jeringa de insulina.
   NOTA: Tenga cuidado de no aspirar aire durante este proceso.

7. Realización de la inyección

1. Identificar las apófisis espinosas L5 y L4.
   NOTA: L6 se encuentra directamente entre las dos crestas ilíacas, y su apófisis espinosa debe ser fácil de identificar mediante un sondeo con un instrumento romo. A continuación, el instrumento se puede deslizar suavemente por la parte posterior para encontrar los límites de los procesos L5 y L4.
2. Coloque una mano de modo que el pulgar descanse suavemente sobre la cola y una pata del animal. Use un dedo para estabilizar la jeringa.
3. Coloque la aguja de la jeringa de modo que quede a la izquierda de la apófisis espinosa L5 y alineada con su extremo caudal. Coloque la jeringa de manera que esté a unos 30° de la línea media y 30° hacia arriba del plano de la mesa.
   NOTA: Puede ser útil utilizar un microscopio quirúrgico para identificar mejor los puntos de referencia y colocar la punta de la aguja.
4. Avance la aguja de la jeringa hacia adelante unos 8 mm, sobre la parte superior de la lámina L5 y luego debajo de la lámina L4 en la cisterna lumbar hasta que se golpee el hueso. La colocación correcta dará como resultado una contracción de la pata y/o la cola que se puede ver o sentir con el pulgar apoyado en la pata/cola. Si no hay espasmo, retire la aguja e intente el procedimiento desde el lado izquierdo. Si aún no hay contracción, repita el procedimiento entre L4/L3 y L3/L2 según sea necesario.
5. Presione el émbolo lentamente durante unos 5 s.
   NOTA: Puede haber un tic en la pata o la cola durante la inyección.
6. Mantenga la jeringa en su lugar durante unos 30 segundos después de presionar completamente el émbolo para permitir que la presión se equilibre y minimice el reflujo de la inyección cuando se retire la aguja.
7. Retire lentamente la aguja.

8. Cierre de la incisión

1. Aproxima los bordes de la incisión.
2. Comenzando en un extremo de la herida, use una sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) o grapas quirúrgicas para cerrar la incisión.

9. Recuperación y seguimiento

1. Coloque al animal en la jaula precalentada.
2. Revise al animal al menos cada 15 minutos hasta que esté completamente ambulatorio.
   NOTA: Esto debería tardar entre 15 minutos y 45 minutos.
3. Durante los próximos tres días, realice controles de bienestar al menos una vez al día. Proporcionar analgésicos durante los primeros 2 días después de la cirugía o según lo requiera la IACUC.
4. Una semana después de la cirugía, retire las suturas o grapas.

10. Procedimiento de seguimiento

NOTA: Para determinar la precisión de la técnica de inyección, inyecte el tinte azul de tripán como se describe anteriormente y luego eutanasique inmediatamente al animal (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y realice una laminectomía para visualizar el resultado.

1. Mientras el animal permanece bajo anestesia, eutanasiarlo administrándole una dosis letal de pentobarbital mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg.
2. Una vez que cesan la respiración y la actividad cardíaca, abra la cavidad torácica para asegurar la muerte. Extienda la incisión quirúrgica por la espalda hasta el cuello.
3. Hacer una incisión de 4 cm de largo en el músculo paralelo a la columna vertebral a ambos lados de las apófisis espinosas, manteniéndolo lo más cerca posible de las apófisis.
4. Con pinzas finas o tijeras, retire el músculo de entre las apófisis espinosas.
5. Retire las apófisis espinosas desde L6 hasta la columna torácica inferior con un rongeur (ver Tabla de Materiales). Evite los movimientos de torsión, ya que esto puede dañar los rongeurs.
6. Inserte la punta inferior del rongeur debajo de la lámina L5 y retire el hueso que recubre la médula espinal sacando varias "mordidas" de él.
   NOTA: Tirar hacia atrás de la apófisis espinosa L6 puede facilitar la inserción de la punta del rongeur. Se debe tener cuidado para evitar daños en la médula espinal.
7. Continuar expandiendo la laminectomía al menos cuatro láminas rostralmente. Inspecciona la superficie interior de las láminas en busca de signos de tinte, lo que puede indicar una inyección fallida.

Resultados

Para determinar la precisión de la técnica de inyección, se utilizó un tinte, el azul de tripano, como sustituto de la terapéutica. Este tinte se une fácilmente a las proteínas, por lo que generalmente permanece dentro de la estructura en la que se inyectó. Esto significa que es posible que el tinte no prediga con precisión la distribución posterior a la inyección del tratamiento; Simplemente se utiliza para revelar la precisión de la inyección. Cuando se introduce con éxito en la cisterna lumbar, el azul d...

Discusión

Una amplia variedad de enfermedades afectan al SNC. Proporcionar una copia funcional del gen relevante a través de un vector viral es una estrategia de tratamiento atractiva para aquellos que son recesivos y de naturaleza monogénica, como la atrofia muscular espinal. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye la mayoría de los vectores de terapia génica administrados por vía intravenosa¹¹. Aquellos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, como el AAV9, deben administrar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection