Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Resumen

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Resumen

La terapia génica es una poderosa tecnología para entregar nuevos genes a un paciente para el tratamiento de una enfermedad, ya sea para introducir un gen funcional, inactivar un gen tóxico o proporcionar un gen cuyo producto pueda modular la biología de la enfermedad. El método de administración del vector terapéutico puede adoptar muchas formas, desde la infusión intravenosa para la administración sistémica hasta la inyección directa en el tejido diana. En el caso de los trastornos neurodegenerativos, a menudo es deseable sesgar la transducción hacia el cerebro y/o la médula espinal. El enfoque menos invasivo para dirigirse a todo el sistema nervioso central implica la inyección en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite que la terapia llegue a una gran fracción del sistema nervioso central. El método más seguro para inyectar un vector en el líquido cefalorraquídeo es la inyección intratecal lumbar, en la que se introduce una aguja en la cisterna lumbar de la médula espinal. Esta técnica, también conocida como punción lumbar, ha sido ampliamente utilizada en roedores neonatos y adultos y en modelos animales grandes. Si bien la técnica es similar en todas las especies y etapas de desarrollo, las diferencias sutiles en el tamaño, la estructura y la elasticidad de los tejidos que rodean el espacio intratecal requieren adaptaciones en el enfoque. En este artículo se describe un método para realizar la punción lumbar en ratas juveniles para administrar un vector adenoasociado al serotipo 9. Aquí, se inyectaron 25-35 μL de vector en la cisterna lumbar y se utilizó un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar el perfil de transducción resultante de cada inyección. Se discuten los beneficios y desafíos de este enfoque.

Introducción

La promesa de las terapias génicas mediadas por virus finalmente se ha hecho realidad en los últimos años con la aprobación de la FDA de tratamientos para la atrofia muscular espinal, la distrofia de retina, la hemofilia del factor IX, el cáncer y más 1,2,3,4. Un sinnúmero de otras terapias están actualmente en desarrollo. La terapia génica tiene como objetivo administrar un gen terapéutico a las células de un paciente. Los productos de este nuevo gen pueden reemplazar la actividad faltante de un gen endógeno deficiente, inhibir un gen tóxic....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (28-30 días de edad, masa en el rango de aproximadamente 90-135 g, machos y hembras).

1. Preparación del vector

1. Descongele el vector AAV9 (consulte la Tabla de materiales) en hielo al comienzo del procedimiento.
2. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrífuga que contiene el vector en una centrífuga de mesa para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo.
3. Agite suavemente el tubo de la....

Discusión

Una amplia variedad de enfermedades afectan al SNC. Proporcionar una copia funcional del gen relevante a través de un vector viral es una estrategia de tratamiento atractiva para aquellos que son recesivos y de naturaleza monogénica, como la atrofia muscular espinal. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye la mayoría de los vectores de terapia génica administrados por vía intravenosa¹¹. Aquellos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, como el AAV9, deben administrar.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection