Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Özet

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Özet

Gen terapisi, işlevsel bir geni tanıtmak, toksik bir geni etkisiz hale getirmek veya ürünü hastalığın biyolojisini modüle edebilen bir gen sağlamak için olsun, hastalığın tedavisi için bir hastaya yeni genler sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Terapötik vektör için uygulama yöntemi, sistemik uygulama için intravenöz infüzyondan hedef dokuya doğrudan enjeksiyona kadar birçok şekilde olabilir. Nörodejeneratif bozukluklar için, transdüksiyonun beyne ve / veya omuriliğe doğru çarpıtılması genellikle arzu edilir. Tüm merkezi sinir sistemini hedeflemek için en az invaziv yaklaşım, beyin omurilik sıvısına (BOS) enjeksiyonu içerir ve terapötiğin merkezi sinir sisteminin büyük bir kısmına ulaşmasını sağlar. Bir vektörü BOS'a iletmek için en güvenli yaklaşım, omuriliğin bel sarnıcına bir iğnenin sokulduğu lomber intratekal enjeksiyondur. Lomber ponksiyon olarak da bilinen bu teknik, yenidoğan ve yetişkin kemirgenlerde ve büyük hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, türler ve gelişim aşamaları arasında benzer olsa da, intratekal boşluğu çevreleyen dokuların boyut, yapı ve elastikiyetindeki ince farklılıklar, yaklaşımda konaklama gerektirir. Bu makale, adeno ilişkili bir serotip 9 vektörü sağlamak için juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon gerçekleştirme yöntemini açıklamaktadır. Burada lomber rezervuara 25-35 μL vektör enjekte edildi ve her enjeksiyondan elde edilen transdüksiyon profilini değerlendirmek için yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanıldı. Bu yaklaşımın yararları ve zorlukları tartışılmaktadır.

Giriş

Viral aracılı gen terapilerinin vaadi, son yıllarda spinal müsküler atrofi, retinal distrofi, faktör IX hemofili, kanser ve daha fazlası için tedavilerin FDA onayı ile nihayet gerçekleşmiştir 1,2,3,4. Sayısız başka terapötik şu anda geliştirilme aşamasındadır. Gen terapisi, bir hastanın hücrelerine terapötik bir gen iletmeyi amaçlar. Bu yeni genin ürünleri, eksik bir endojen genden eksik aktivitenin yerini alabilir, toksik bir geni inhibe edebilir, kanserli hücreleri öldürebilir veya başka bir yararlı işlev sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışma Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (28-30 günlük, yaklaşık 90-135 g aralığında kitle, erkek ve dişiler) kullanıldı.

1. Vektörün hazırlanması

1. Prosedürün başında AAV9 vektörünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözün.
2. Sıvının tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için vektörü içeren mikrosantrifüj tüpünü kısa bir süre masa üstü bir santrifüjde santrifüjleyin.
3. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için mikrosantrifüj tüpünü hafifçe vurun.

Tartışmalar

Çok çeşitli hastalıklar CNS'yi etkiler. Viral bir vektör aracılığıyla ilgili genin fonksiyonel bir kopyasını sağlamak, spinal müsküler atrofi gibi doğası gereği resesif ve monogenik olanlar için çekici bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri (BBB), intravenöz olarak verilen gen terapisi vektörlerinin çoğunu dışlar¹¹. AAV9 gibi BBB'yi geçebilenler, periferik transdüksiyon^12'ye bağlı vektör kaybının üstesinden gelmek iç.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection