Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Özet

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Özet

Gen terapisi, işlevsel bir geni tanıtmak, toksik bir geni etkisiz hale getirmek veya ürünü hastalığın biyolojisini modüle edebilen bir gen sağlamak için olsun, hastalığın tedavisi için bir hastaya yeni genler sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Terapötik vektör için uygulama yöntemi, sistemik uygulama için intravenöz infüzyondan hedef dokuya doğrudan enjeksiyona kadar birçok şekilde olabilir. Nörodejeneratif bozukluklar için, transdüksiyonun beyne ve / veya omuriliğe doğru çarpıtılması genellikle arzu edilir. Tüm merkezi sinir sistemini hedeflemek için en az invaziv yaklaşım, beyin omurilik sıvısına (BOS) enjeksiyonu içerir ve terapötiğin merkezi sinir sisteminin büyük bir kısmına ulaşmasını sağlar. Bir vektörü BOS'a iletmek için en güvenli yaklaşım, omuriliğin bel sarnıcına bir iğnenin sokulduğu lomber intratekal enjeksiyondur. Lomber ponksiyon olarak da bilinen bu teknik, yenidoğan ve yetişkin kemirgenlerde ve büyük hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, türler ve gelişim aşamaları arasında benzer olsa da, intratekal boşluğu çevreleyen dokuların boyut, yapı ve elastikiyetindeki ince farklılıklar, yaklaşımda konaklama gerektirir. Bu makale, adeno ilişkili bir serotip 9 vektörü sağlamak için juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon gerçekleştirme yöntemini açıklamaktadır. Burada lomber rezervuara 25-35 μL vektör enjekte edildi ve her enjeksiyondan elde edilen transdüksiyon profilini değerlendirmek için yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanıldı. Bu yaklaşımın yararları ve zorlukları tartışılmaktadır.

Giriş

Viral aracılı gen terapilerinin vaadi, son yıllarda spinal müsküler atrofi, retinal distrofi, faktör IX hemofili, kanser ve daha fazlası için tedavilerin FDA onayı ile nihayet gerçekleşmiştir 1,2,3,4. Sayısız başka terapötik şu anda geliştirilme aşamasındadır. Gen terapisi, bir hastanın hücrelerine terapötik bir gen iletmeyi amaçlar. Bu yeni genin ürünleri, eksik bir endojen genden eksik aktivitenin yerini alabilir, toksik bir geni inhibe edebilir, kanserli hücreleri öldürebilir veya başka bir yararlı işlev sağlayabilir.

Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen hastalıklar için, gen terapisi vektörünün doğrudan hedef dokuya verilmesi genellikle arzu edilir. Sistemik olmayan yaklaşımlar iki fayda sağlar: periferik transdüksiyonun neden olabileceği hedef dışı yan etkileri en aza indirirler ve hedef dokuda yeterli transdüksiyon seviyelerine ulaşmak için gereken vektör miktarını büyük ölçüde azaltırlar⁵.

Gen terapisi vektörlerini CNS'ye iletmek için çeşitli yaklaşımlar vardır. Bir vektörün doğrudan omuriliğe veya beyin dokusuna enjekte edilmesi olan intraparankimal enjeksiyon, tanımlanmış bir bölgeye vermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, birçok hastalık için, CNS'nin geniş transdüksiyonu arzu edilir. Bu, beyin ve omurilik içinde ve çevresinde akan sıvı olan beyin omurilik sıvısına (BOS)⁵ bir vektör verilerek gerçekleştirilebilir. Vektörleri CSF'ye iletmenin üç ana yolu vardır. En invaziv yaklaşım, kafatasından bir çapak deliği açmayı ve beyinden lateral ventriküllere bir iğne ilerletmeyi içeren intraserebroventriküler doğumdur. Bu, beyin boyunca transdüksiyon sağlar. Bununla birlikte, prosedür intrakraniyal kanamaya neden olabilir ve yaklaşım genellikle omuriliğin sadece sınırlı transdüksiyonunu sağlar⁶. Kafatasının tabanındaki cisterna magna'ya enjeksiyon daha az invazivdir, ancak beyin sapına zarar verme riski taşır. Hayvan araştırmalarında sıklıkla kullanılsa^da5, cisterna magna'ya enjeksiyon artık klinikte rutin olarak kullanılmamaktadır⁷. Lomber ponksiyon, BOS'a erişmek için en az invaziv yaklaşımdır. Bu, iki bel omuru arasına ve bel sarnıcına bir iğne yerleştirilmesini içerir.

Vektör iletimi için lomber ponksiyon, yetişkin sıçanlarda ve farelerde ve yenidoğan farelerde rutin olarak gerçekleştirilir ^8,9. Bu çalışmanın yazarları yakın zamanda adeno ilişkili virüs serotip 9 (AAV9) vektörleri sağlamak için genç sıçanlarda (28-30 günlük) lomber ponksiyonlar gerçekleştirdiler. Yetişkin sıçanlarda, L3 ve L4 omurları⁹ arasına dikey olarak bir neonatal lomber ponksiyon iğnesi yerleştirildi. Doğru yerleştirme, bir kuyruk hareketi ve BOS'un iğne haznesine akmasına neden olur. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu okumaların hiçbiri elde edilemedi. Yazarlar daha sonra L5 ve L6¹⁰ arasında bir açıyla yerleştirilmiş 27 G'lik bir insülin şırıngası kullanarak yetişkin bir fare prosedürünü uyarlamaya çalıştılar. Tipik olarak P28 sıçanlarından daha küçük olan yetişkin farelerde, bu bir kuyruk hareketine neden olmaz, ancak yanlış iğne yerleşimi, enjeksiyonun geri akışı ile belirgindir. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu yaklaşım, muhtemelen yetişkin fareler ile omuriliği çevreleyen doku katmanlarının genç sıçanları arasındaki farklı elastikiyetten kaynaklanan, enjekte edilen enklavatın epidural olarak verilmesine eşit şekilde yol açmıştır. Daha sonra kateter yaklaşımları değerlendirildi. Spesifik olarak, lomber sarnıcın durasında ve orta torasik omuriliğe kadar bir kesiden bir kateter sokuldu; Bununla birlikte, bu yaklaşım, enjeksiyon sırasında enjeksiyonun insizyon bölgesinden önemli ölçüde geri akışına yol açmıştır. Kateteri bir kılavuz iğne kullanarak perkütan olarak intratekal boşluğa yerleştirme girişimleri de başarısız oldu. İnterlaminar genişliğin darlığı nedeniyle, kateter muhtemelen rostral laminaya çarpacak ve ilerleymeyecektir.

Burada, juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon yoluyla başarılı ve tekrarlanabilir solüsyon iletimi elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım viral vektörler için ve muhtemelen hücreler, farmasötikler ve diğer terapötikler için de kullanılabilir.

Protokol

Bu çalışma Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (28-30 günlük, yaklaşık 90-135 g aralığında kitle, erkek ve dişiler) kullanıldı.

1. Vektörün hazırlanması

1. Prosedürün başında AAV9 vektörünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözün.
2. Sıvının tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için vektörü içeren mikrosantrifüj tüpünü kısa bir süre masa üstü bir santrifüjde santrifüjleyin.
3. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için mikrosantrifüj tüpünü hafifçe vurun.

2. Kurtarma kafesinin hazırlanması

1. Elektrikli battaniyenin üzerine temiz bir kafes yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın), böylece kafesin sadece yarısı battaniyeyle temas eder.
2. Battaniyenin sıcaklığını ~37 °C'ye ayarlayın.

3. Cerrahi platformun hazırlanması

1. Bir izotermal pedi ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir mikrodalga veya su banyosunda 39 ° C'ye ısıtın, böylece içerik sıvı hale gelir.
2. İzotermal pedi cerrahi platforma yerleştirin ve temiz bir emici tezgah pedi ile örtün.

4. Hayvan hazırlama

1. Sıçanları şeffaf bir kutuda izofluran ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Anestezi indüksiyonuna %5 izofluran kullanarak başlayın ve %2'ye ulaşana kadar dakikada %1 azaltın. Hayvanı 3 dakika daha% 2'de tutun.
2. Hayvanı tutan kutuyu bir davlumbazın üzerine getirin ve kutuyu açın.
   NOT: Bu, cerrahın anesteziye maruz kalmasını sınırlar.
3. Elektrikli saç kesme makineleri kullanarak hayvanın arkasındaki tüyleri alın.
   NOT: Alternatif olarak, tüy dökücü krem veya manuel tıraş bıçağı ve tıraş kremi kullanılabilir.
4. Hayvanı, burnu anestezi burun konisinde olacak şekilde cerrahi platforma yerleştirin.
   NOT: Kürk ameliyat bölgesinden çıkarılırken hayvan bilincini yeniden kazanmaya başlayabilir. Bu olursa, yukarıda anlatıldığı gibi tekrar uyuşturun.
5. İşlem sırasında korneaların kurumasını önlemek için her göze kayganlaştırıcı göz merhemi sürün.
6. Povidon-iyot ve izopropanol mendillerin üç alternatif uygulamasını kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin.
7. Analjezik (ler) i deri altına enjekte edin.
   NOT: Buprenorfin genellikle her 12 saatte bir verilen 0.01-0.05 mg / kg'lık bir dozda kullanılır. Alternatif olarak, bu ilacın yavaş salınan bir formu, 72 saat boyunca yeterli ağrı kontrolü sağlamak için 1 mg / kg'da bir kez verilebilir. Ağrı yönetimi ile ilgili yönergeleri için kurumun IACUC'sine danışın.
8. Lokal anestezi sağlamak için L2 ila L6 spinöz işlemlerinin üzerine deri altından 100 μL% 1 lidokain enjekte edin.
9. Hayvanın altına bir rulo kağıt havlu veya 1,5 cm çapında bir tüp yerleştirin, sadece kalçalara kadar uzanın. Bu, omurganın esnemesine yardımcı olur ve iğneyi iki lamina arasına sokmayı kolaylaştırır.
10. Hayvanın üzerine fenestre bir örtü yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve fenestrasyonu bel omurgası üzerinde ortalayın.

5. Lomber omurganın açığa çıkarılması

1. Hayvanın pençelerinin her birini sıkıştırarak ve geri çekilme tepkisinin olmadığını arayarak anestezi derinliğini onaylayın.
2. # 11 neşter bıçağı kullanarak, L2'den L6'ya kadar orta hattan aşağı doğru deride yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun.
3. Kas ile cilt arasına steril kavisli bir çift cerrahi makas sokarak ve ardından uçları açarak cildi kastan gevşetin.
4. L2-L5 spinöz süreçleri kaplayan fasyayı çıkarın.

6. Şırınganın yüklenmesi

1. Vektörün 25-35 μL'sini (istenen dozu elde etmek için) steril bir mikrosantrifüj tüpünün kapağına pipetleyin.
2. Tüm hacmi insülin şırıngasına çekin.
   NOT: Bu işlem sırasında hava çekmemeye özen gösteriniz.

7. Enjeksiyonun yapılması

1. L5 ve L4 spinöz süreçlerini tanımlayın.
   NOT: L6 doğrudan iki iliak tepe arasında yer alır ve dikenli sürecinin, künt bir aletle sondalama yoluyla tanımlanması kolay olmalıdır. Cihaz daha sonra L5 ve L4 işlemlerinin sınırlarını bulmak için yavaşça arkaya doğru hareket ettirilebilir.
2. Bir elinizi, başparmağınız hayvanın kuyruğuna ve bir bacağına nazikçe dayanacak şekilde yerleştirin. Şırıngayı sabitlemek için parmağınızı kullanın.
3. Şırınganın iğnesini, L5 dikenli işlemin solunda olacak ve kaudal ucu ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırın. Şırıngayı, orta hattan yaklaşık 30° uzakta ve masanın düzleminden 30° yukarıda olacak şekilde konumlandırın.
   NOT: Yer işaretlerini daha iyi tanımlamak ve iğnenin ucunu konumlandırmak için cerrahi mikroskop kullanmak yardımcı olabilir.
4. Şırınga iğnesini yaklaşık 8 mm ileri, L5 laminasının üstünden ve ardından L4 laminasının altından kemiğe vurulana kadar bel rezervuarına ilerletin. Doğru yerleştirme, bacak/kuyruk üzerinde duran başparmak tarafından görülebilen veya hissedilebilen bir bacak ve/veya kuyruk seğirmesine neden olacaktır. Seğirme yoksa, iğneyi çıkarın ve işlemi sol taraftan deneyin. Hala seğirme yoksa, prosedürü gerektiği gibi L4/L3 ve L3/L2 arasında tekrarlayın.
5. Pistona yaklaşık 5 saniye boyunca yavaşça bastırın.
   NOT: Enjeksiyon sırasında bacakta veya kuyrukta seğirme olabilir.
6. İğne geri çekildiğinde basıncın dengelenmesini sağlamak ve enjeksiyonun geri akışını en aza indirmek için pistona tamamen bastırdıktan sonra şırıngayı yaklaşık 30 saniye yerinde tutun.
7. İğneyi yavaşça çıkarın.

8. Kesinin kapatılması

1. Kesiğin kenarlarını yaklaşık olarak ölçün.
2. Yaranın bir ucundan başlayarak, kesiyi kapatmak için 4-0 dikiş (Malzeme Tablosuna bakınız) veya cerrahi zımba kullanın.

9. Kurtarma ve izleme

1. Hayvanı önceden ısıtılmış kafese yerleştirin.
2. Hayvanı tamamen gezdirilene kadar en az 15 dakikada bir kontrol edin.
   NOT: Bu işlem 15 dakika ile 45 dakika arasında sürmelidir.
3. Önümüzdeki üç gün boyunca, en az her gün sağlık kontrolleri yapın. Ameliyattan sonraki ilk 2 gün veya IACUC'un gerektirdiği şekilde analjezik sağlayın.
4. Ameliyattan bir hafta sonra dikişleri veya zımbaları çıkarın.

10. Takip prosedürü

NOT: Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, yukarıda tarif edildiği gibi tripan mavisi boya enjekte edin ve ardından hayvanı hemen ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sonucu görselleştirmek için bir laminektomi yapın.

1. Hayvan anestezi altında kalırken, 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla öldürücü bir dozda pentobarbital uygulayarak ötenazi yapın.
2. Solunum ve kardiyak aktivite durduğunda, ölümü sağlamak için göğüs boşluğunu açın. Cerrahi kesiyi sırttan boynuna kadar uzatın.
3. Spinöz işlemlerin her iki tarafında omurgaya paralel kas içine 4 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve işlemlere mümkün olduğunca yakın tutun.
4. İnce forseps veya makas kullanarak, kasları dikenli süreçler arasından çıkarın.
5. Bir rongeur kullanarak L6'dan alt torasik omurgaya kadar olan dikenli süreçleri çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Rongeurlara zarar verebileceğinden bükme hareketlerinden kaçının.
6. Rongeur'un alt ucunu L5 laminanın altına yerleştirin ve omuriliğin üzerindeki kemiği birkaç "ısırık" alarak çıkarın.
   NOT: L6 dikenli işlemi geri çekmek, rongeur'un ucunu yerleştirmeyi kolaylaştırabilir. Omuriliğin zarar görmesini önlemek için özen gösterilmelidir.
7. Laminektomiyi rostral olarak en az dört lamina genişletmeye devam edin. Laminaların iç yüzeyini, başarısız bir enjeksiyonu gösterebilecek boya belirtileri açısından inceleyin.

Sonuçlar

Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, terapötik için bir vekil olarak bir boya, tripan mavisi kullanıldı. Bu boya proteinlere kolayca bağlanır, bu nedenle genellikle enjekte edildiği yapı içinde kalır. Bu, boyanın terapötiğin enjeksiyon sonrası dağılımını doğru bir şekilde tahmin edemeyebileceği anlamına gelir; Sadece enjeksiyonun doğruluğunu ortaya çıkarmak için kullanılır. Bel sarnıcına başarılı bir şekilde sokulduğunda, tripan mavisi dura mater'e bağlanır ve omur...

Tartışmalar

Çok çeşitli hastalıklar CNS'yi etkiler. Viral bir vektör aracılığıyla ilgili genin fonksiyonel bir kopyasını sağlamak, spinal müsküler atrofi gibi doğası gereği resesif ve monogenik olanlar için çekici bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri (BBB), intravenöz olarak verilen gen terapisi vektörlerinin çoğunu dışlar¹¹. AAV9 gibi BBB'yi geçebilenler, periferik transdüksiyon^12'ye bağlı vektör kaybının üstesinden gelmek iç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection