Administration intrathécale de vecteurs chez des rats juvéniles par injection dans une citerne lombaire

Résumé

Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.

Résumé

La thérapie génique est une technologie puissante pour fournir de nouveaux gènes à un patient pour le traitement d’une maladie, qu’il s’agisse d’introduire un gène fonctionnel, d’inactiver un gène toxique ou de fournir un gène dont le produit peut moduler la biologie de la maladie. La méthode d’administration du vecteur thérapeutique peut prendre de nombreuses formes, allant de la perfusion intraveineuse pour une administration systémique à l’injection directe dans le tissu cible. Pour les troubles neurodégénératifs, il est souvent souhaitable d’incliner la transduction vers le cerveau et/ou la moelle épinière. L’approche la moins invasive pour cibler l’ensemble du système nerveux central consiste à injecter dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), ce qui permet au traitement d’atteindre une grande partie du système nerveux central. L’approche la plus sûre pour administrer un vecteur dans le LCR est l’injection intrathécale lombaire, où une aiguille est introduite dans la citerne lombaire de la moelle épinière. Cette technique, également connue sous le nom de ponction lombaire, a été largement utilisée chez les rongeurs néonatals et adultes et dans les modèles de grands animaux. Bien que la technique soit similaire entre les espèces et les stades de développement, des différences subtiles de taille, de structure et d’élasticité des tissus entourant l’espace intrathécal nécessitent des adaptations dans l’approche. Cet article décrit une méthode permettant d’effectuer une ponction lombaire chez des rats juvéniles afin d’administrer un vecteur de sérotype 9 adéno-associé. Ici, 25 à 35 μL de vecteur ont été injectés dans la citerne lombaire, et un rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisé pour évaluer le profil de transduction résultant de chaque injection. Les avantages et les défis de cette approche sont discutés.

Introduction

La promesse des thérapies géniques à médiation virale s’est finalement concrétisée ces dernières années avec l’approbation par la FDA de traitements pour l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne, l’hémophilie par facteur IX, le cancer, ^etc. D’innombrables autres traitements sont actuellement en cours de développement. La thérapie génique vise à délivrer un gène thérapeutique aux cellules d’un patient. Les produits de ce nouveau gène peuvent remplacer l’activité manquante d’un gène endogène déficient, inhiber un gène toxique, tuer les ....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Emory (IACUC). Des rats Sprague-Dawley (âgés de 28 à 30 jours, masse d’environ 90 à 135 g, mâles et femelles) ont été utilisés dans la présente étude.

1. Préparation du vecteur

1. Décongeler le vecteur AAV9 (voir le tableau des matériaux) sur de la glace au début de l’intervention.
2. Centrifugez brièvement le tube de microcentrifugation contenant le vecteur dans une centrifugeuse de table pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube.
3. Agitez doucement le tu....

Discussion

Une grande variété de maladies affectent le SNC. Fournir une copie fonctionnelle du gène pertinent via un vecteur viral est une stratégie de traitement attrayante pour ceux qui sont récessifs et monogéniques par nature, comme l’amyotrophie spinale. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BHE) exclut la plupart des vecteurs de thérapie génique administrés par voie intraveineuse¹¹. Ceux qui peuvent traverser la BHE, comme l’AAV9, doivent être administrés à fortes doses pour su.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection