Administration intrathécale de vecteurs chez des rats juvéniles par injection dans une citerne lombaire

Résumé

Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.

Résumé

La thérapie génique est une technologie puissante pour fournir de nouveaux gènes à un patient pour le traitement d’une maladie, qu’il s’agisse d’introduire un gène fonctionnel, d’inactiver un gène toxique ou de fournir un gène dont le produit peut moduler la biologie de la maladie. La méthode d’administration du vecteur thérapeutique peut prendre de nombreuses formes, allant de la perfusion intraveineuse pour une administration systémique à l’injection directe dans le tissu cible. Pour les troubles neurodégénératifs, il est souvent souhaitable d’incliner la transduction vers le cerveau et/ou la moelle épinière. L’approche la moins invasive pour cibler l’ensemble du système nerveux central consiste à injecter dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), ce qui permet au traitement d’atteindre une grande partie du système nerveux central. L’approche la plus sûre pour administrer un vecteur dans le LCR est l’injection intrathécale lombaire, où une aiguille est introduite dans la citerne lombaire de la moelle épinière. Cette technique, également connue sous le nom de ponction lombaire, a été largement utilisée chez les rongeurs néonatals et adultes et dans les modèles de grands animaux. Bien que la technique soit similaire entre les espèces et les stades de développement, des différences subtiles de taille, de structure et d’élasticité des tissus entourant l’espace intrathécal nécessitent des adaptations dans l’approche. Cet article décrit une méthode permettant d’effectuer une ponction lombaire chez des rats juvéniles afin d’administrer un vecteur de sérotype 9 adéno-associé. Ici, 25 à 35 μL de vecteur ont été injectés dans la citerne lombaire, et un rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisé pour évaluer le profil de transduction résultant de chaque injection. Les avantages et les défis de cette approche sont discutés.

Introduction

La promesse des thérapies géniques à médiation virale s’est finalement concrétisée ces dernières années avec l’approbation par la FDA de traitements pour l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne, l’hémophilie par facteur IX, le cancer, ^etc. D’innombrables autres traitements sont actuellement en cours de développement. La thérapie génique vise à délivrer un gène thérapeutique aux cellules d’un patient. Les produits de ce nouveau gène peuvent remplacer l’activité manquante d’un gène endogène déficient, inhiber un gène toxique, tuer les cellules cancéreuses ou fournir une autre fonction bénéfique.

Pour les maladies affectant le système nerveux central (SNC), il est souvent souhaitable d’administrer le vecteur de thérapie génique directement au tissu cible. Les approches non systémiques offrent deux avantages : elles minimisent les effets secondaires hors cible qui peuvent être causés par la transduction périphérique, et elles réduisent considérablement la quantité de vecteur nécessaire pour atteindre des niveaux adéquats de transduction dans le tissu cible⁵.

Il existe une variété d’approches pour administrer des vecteurs de thérapie génique au SNC. L’injection intraparenchymateuse, c’est-à-dire l’injection d’un vecteur directement dans la moelle épinière ou le tissu cérébral, peut être utilisée pour l’administration dans une région définie. Cependant, pour de nombreuses maladies, une large transduction du SNC est souhaitée. Cela peut être accompli en délivrant un vecteur dans le liquide céphalo-rachidien (LCR)⁵, le liquide qui circule dans et autour du cerveau et de la moelle épinière. Il existe trois façons principales d’acheminer des vecteurs vers la PPC. L’approche la plus invasive est l’administration intra-ventriculaire, qui consiste à percer un trou de bavure à travers le crâne et à faire avancer une aiguille à travers le cerveau dans les ventricules latéraux. Cela produit une transduction dans tout le cerveau. Cependant, la procédure peut provoquer une hémorragie intracrânienne, et l’approche ne produit généralement qu’une transduction limitée de la moelle épinière⁶. L’injection dans la citerne magna à la base du crâne est moins invasive, mais comporte un risque de lésions du tronc cérébral. Bien qu’elle soit souvent utilisée dans la recherche animale⁵, l’injection dans la citerne magna n’est plus utilisée systématiquement en clinique⁷. La ponction lombaire est l’approche la moins invasive pour accéder au LCR. Il s’agit de placer une aiguille entre deux vertèbres lombaires et dans la citerne lombaire.

La ponction lombaire pour l’administration de vecteurs est couramment pratiquée chez les rats et les souris adultes et chez les souris néonatales ^8,9. Les auteurs de cette étude ont récemment effectué des ponctions lombaires chez des rats juvéniles (âgés de 28 à 30 jours) pour administrer des vecteurs du virus adéno-associé de sérotype 9 (AAV9). Chez des rats adultes, une aiguille de ponction lombaire néonatale a été placée verticalement entre les vertèbres L3 et L4⁹. Un bon placement entraîne un mouvement de la queue et un écoulement du LCR dans le réservoir de l’aiguille. Chez les rats juvéniles, cependant, aucune de ces lectures n’a pu être réalisée. Les auteurs ont ensuite tenté d’adapter une procédure sur une souris adulte à l’aide d’une seringue à insuline de 27 G insérée à un angle compris entre L5 et L6¹⁰. Chez les souris adultes, qui sont généralement plus petites que les rats P28, cela ne produit pas de battement de queue, mais un mauvais placement de l’aiguille est évident par le reflux de l’injecté. Chez les rats juvéniles, cependant, cette approche a uniformément conduit à l’administration de l’injectat par voie épidurale, probablement en raison de l’élasticité différente entre les souris adultes et les rats juvéniles des couches tissulaires entourant la moelle épinière. Les approches par cathéter ont ensuite été évaluées. Plus précisément, un cathéter a été introduit par une incision dans la dure-mère de la citerne lombaire et jusqu’à la moelle épinière mi-thoracique ; Cependant, cette approche a entraîné un reflux important de l’injectat hors du site d’incision pendant l’accouchement. Les tentatives de placer le cathéter dans l’espace intrathécal par voie percutanée à l’aide d’une aiguille guide ont également été infructueuses. En raison de l’étroitesse de la largeur interlaminaire, le cathéter heurterait probablement la lame rostrale et ne progresserait pas.

Ici, une méthode est décrite pour obtenir une administration réussie et reproductible de la solution par ponction lombaire chez le rat juvénile. Cette approche peut être utilisée pour les vecteurs viraux, et probablement aussi pour les cellules, les produits pharmaceutiques et d’autres traitements.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Emory (IACUC). Des rats Sprague-Dawley (âgés de 28 à 30 jours, masse d’environ 90 à 135 g, mâles et femelles) ont été utilisés dans la présente étude.

1. Préparation du vecteur

1. Décongeler le vecteur AAV9 (voir le tableau des matériaux) sur de la glace au début de l’intervention.
2. Centrifugez brièvement le tube de microcentrifugation contenant le vecteur dans une centrifugeuse de table pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube.
3. Agitez doucement le tube de microcentrifugation pour vous assurer que la solution est bien mélangée.

2. Préparation de la cage de récupération

1. Placez une cage propre sur une couverture électrique (voir le tableau des matériaux) de sorte que seule la moitié de la cage soit en contact avec la couverture.
2. Réglez la température de la couverture à ~37 °C.

3. Préparation de la plate-forme chirurgicale

1. Réchauffez un tampon isotherme (voir le tableau des matières) à 39 °C au micro-ondes ou au bain-marie afin que le contenu devienne liquide.
2. Placez le tampon isotherme sur la plate-forme chirurgicale et couvrez-le d’un tampon de paillasse absorbant et propre.

4. Préparation des animaux

1. Anesthésier les rats avec de l’isoflurane dans une boîte transparente (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Commencer l’induction de l’anesthésie à l’aide de 5 % d’isoflurane et diminuer de 1 % par minute jusqu’à atteindre 2 %. Maintenez l’animal à 2 % pendant 3 min supplémentaires.
2. Déplacez la boîte qui maintient l’animal dans une hotte et ouvrez la boîte.
   REMARQUE : Cela limite l’exposition du chirurgien à l’anesthésique.
3. Retirez les poils du dos de l’animal à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
   REMARQUE : Alternativement, une crème dépilatoire ou un rasoir manuel et de la crème à raser peuvent être utilisés.
4. Placez l’animal sur la plate-forme chirurgicale avec son museau dans le cône nasal d’anesthésie.
   REMARQUE : L’animal peut commencer à reprendre conscience pendant que la fourrure est retirée du site chirurgical. Si cela se produit, anesthésez-le à nouveau comme décrit ci-dessus.
5. Appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur chaque œil pour éviter le dessèchement des cornées pendant la procédure.
6. Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide de trois applications alternées de lingettes de povidone iodée et d’isopropanol.
7. Injecter le(s) antalgique(s) sous-cutané(s).
   REMARQUE : La buprénorphine est généralement utilisée à une dose de 0,01 à 0,05 mg/kg, administrée toutes les 12 heures. Alternativement, une forme à libération lente de ce médicament peut être administrée une fois à 1 mg/kg pour fournir un contrôle adéquat de la douleur pendant 72 heures. Consultez l’IACUC de l’établissement pour connaître ses directives concernant la gestion de la douleur.
8. Injecter 100 μL de lidocaïne à 1 % par voie sous-cutanée au-dessus des apophyses épineuses L2 à L6 pour fournir une anesthésie locale.
9. Placez un rouleau d’essuie-tout ou un tube de 1,5 cm de diamètre sous l’animal, juste rostral jusqu’aux hanches. Cela aide à fléchir la colonne vertébrale, ce qui facilite l’insertion de l’aiguille entre les deux lames.
10. Placez un rideau fenêtré (voir le tableau des matériaux) sur l’animal, en centrant la fenestration sur la colonne lombaire.

5. Exposer la colonne lombaire

1. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant chacune des pattes de l’animal et en recherchant l’absence de réponse de retrait.
2. À l’aide d’une lame de scalpel #11, créez une incision d’environ 3 cm de long dans la peau le long de la ligne médiane de L2 à L6.
3. Détachez la peau du muscle en insérant une paire de ciseaux chirurgicaux incurvés stériles entre le muscle et la peau, puis en ouvrant les pointes.
4. Retirez le fascia recouvrant les apophyses épineuses L2-L5.

6. Chargement de la seringue

1. Pipeter 25-35 μL du vecteur (pour obtenir la dose souhaitée) dans le capuchon d’un tube de microcentrifugation stérile.
2. Aspirez tout le volume dans la seringue à insuline.
   REMARQUE : Veillez à ne pas aspirer d’air pendant ce processus.

7. Réalisation de l’injection

1. Identifier les apophyses épineuses L5 et L4.
   REMARQUE : L6 se trouve directement entre les deux crêtes iliaques, et son apophyse épineuse devrait être facile à identifier en sondant avec un instrument contondant. L’instrument peut ensuite être doucement passé à l’arrière pour trouver les limites des processus L5 et L4.
2. Placez une main de manière à ce que le pouce repose doucement sur la queue et une patte de l’animal. Utilisez un doigt pour stabiliser la seringue.
3. Positionnez l’aiguille de la seringue de manière à ce qu’elle soit à gauche de l’apophyse épineuse L5 et alignée avec son extrémité caudale. Positionnez la seringue de manière à ce qu’elle soit à environ 30° de la ligne médiane et à 30° vers le haut du plan de la table.
   REMARQUE : Il peut être utile d’utiliser un microscope chirurgical pour mieux identifier les points de repère et positionner la pointe de l’aiguille.
4. Avancez l’aiguille de la seringue vers l’avant d’environ 8 mm, au-dessus de la lame L5, puis sous la lame L4 dans la citerne lombaire jusqu’à ce que l’os soit touché. Un placement correct entraînera une contraction de la patte et/ou de la queue qui peut être vue ou ressentie par le pouce reposant sur la patte/la queue. S’il n’y a pas de contraction, retirez l’aiguille et essayez la procédure par le côté gauche. S’il n’y a toujours pas de contraction, répétez la procédure entre L4/L3 et L3/L2 si nécessaire.
5. Appuyez lentement sur le piston pendant environ 5 s.
   REMARQUE : Il peut y avoir une contraction dans la jambe ou la queue pendant l’injection.
6. Maintenez la seringue en place pendant environ 30 secondes après avoir enfoncé complètement le piston pour permettre à la pression de s’équilibrer et minimiser le reflux de l’injectat lorsque l’aiguille est retirée.
7. Retirez lentement l’aiguille.

8. Fermeture de l’incision

1. Approximez les bords de l’incision.
2. En commençant par une extrémité de la plaie, utilisez une suture 4-0 (voir le tableau des matériaux) ou des agrafes chirurgicales pour fermer l’incision.

9. Récupération et surveillance

1. Placez l’animal dans la cage préchauffée.
2. Vérifiez l’animal au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire.
   REMARQUE : Cela devrait prendre entre 15 min et 45 min.
3. Pendant les trois prochains jours, effectuez des contrôles de bien-être au moins une fois par jour. Fournir des analgésiques pendant les 2 premiers jours suivant la chirurgie ou selon les exigences de l’IACUC.
4. Une semaine après la chirurgie, retirez les sutures ou les agrafes.

10. Procédure de suivi

REMARQUE : Pour déterminer l’exactitude de la technique d’injection, injectez le colorant bleu trypan tel que décrit ci-dessus, puis euthanasiez immédiatement l’animal (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement) et effectuez une laminectomie pour visualiser le résultat.

1. Pendant que l’animal reste sous anesthésie, euthanasiez-le en lui administrant une dose létale de pentobarbital par injection intrapéritonéale à une dose de 150 mg/kg.
2. Une fois que la respiration et l’activité cardiaque cessent, ouvrez la cavité thoracique pour assurer la mort. Prolongez l’incision chirurgicale vers le dos jusqu’au cou.
3. Faites une incision de 4 cm de long dans le muscle parallèlement à la colonne vertébrale des deux côtés des apophyses épineuses, en restant aussi proche que possible des apophyses.
4. À l’aide d’une pince fine ou de ciseaux, retirez le muscle entre les apophyses épineuses.
5. Retirez les apophyses épineuses de la L6 jusqu’à la partie inférieure de la colonne thoracique à l’aide d’un rongeur (voir tableau des matériaux). Évitez les mouvements de torsion, car cela pourrait endommager les rongeurs.
6. Insérez l’extrémité inférieure du rongeur sous la lame L5 et retirez l’os recouvrant la moelle épinière en prélevant plusieurs « morsures » de celle-ci.
   REMARQUE : En tirant sur l’apophyse épineuse L6, il peut être plus facile d’insérer l’extrémité du rongeur. Des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager la moelle épinière.
7. Continuez à élargir la laminectomie d’au moins quatre lames rostrallyes. Inspectez la surface intérieure des lames pour détecter des signes de colorant, ce qui peut indiquer un échec de l’injection.

Résultats

Pour déterminer la précision de la technique d’injection, un colorant, le bleu de trypan, a été utilisé comme substitut du traitement. Ce colorant se lie facilement aux protéines, de sorte qu’il reste généralement dans la structure dans laquelle il a été injecté. Cela signifie que le colorant peut ne pas prédire avec précision la distribution post-injection du produit thérapeutique ; Il est simplement utilisé pour révéler la précision de l’injection. Lorsqu’il est introduit avec succès dans la ...

Discussion

Une grande variété de maladies affectent le SNC. Fournir une copie fonctionnelle du gène pertinent via un vecteur viral est une stratégie de traitement attrayante pour ceux qui sont récessifs et monogéniques par nature, comme l’amyotrophie spinale. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BHE) exclut la plupart des vecteurs de thérapie génique administrés par voie intraveineuse¹¹. Ceux qui peuvent traverser la BHE, comme l’AAV9, doivent être administrés à fortes doses pour su...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection