Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

요약

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

초록

유전자 치료는 기능적 유전자를 도입하거나, 독성 유전자를 비활성화하거나, 질병의 생물학적 특성을 조절할 수 있는 유전자를 제공하는 등 질병 치료를 위해 환자에게 새로운 유전자를 전달하는 강력한 기술입니다. 치료 벡터에 대한 전달 방법은 전신 전달을 위한 정맥 주입에서 표적 조직에 직접 주입에 이르기까지 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환의 경우, 뇌 및/또는 척수 쪽으로 transduction을 치우는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 전체 중추신경계를 표적으로 하는 최소 침습적 접근법은 뇌척수액(CSF)에 주사하여 치료제가 중추신경계의 많은 부분에 도달할 수 있도록 하는 것입니다. 뇌척수액에 벡터를 전달하는 가장 안전한 방법은 척수의 요추 수조에 바늘을 삽입하는 요추 척수강내 주사입니다. 요추 천자라고도 하는 이 기술은 신생아 및 성인 설치류와 대형 동물 모델에 널리 사용되었습니다. 이 기술은 종과 발달 단계에 따라 유사하지만 척수강내 공간을 둘러싼 조직의 크기, 구조 및 탄성의 미묘한 차이로 인해 접근 방식에 적응이 필요합니다. 이 기사에서는 아데노 관련 혈청형 9 벡터를 전달하기 위해 어린 쥐에서 요추 천자를 수행하는 방법을 설명합니다. 여기에서 25-35 μL의 벡터를 요추 수조에 주입하고 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 사용하여 각 주입으로 인한 transduction profile을 평가했습니다. 이 접근 방식의 이점과 과제에 대해 설명합니다.

서문

바이러스 매개 유전자 치료의 가능성은 최근 몇 년 동안 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 인자 IX 혈우병, 암 등에 대한 치료법에 대한 FDA 승인으로 마침내 실현되었습니다 1,2,3,4. 현재 수많은 다른 치료법이 개발 중입니다. 유전자 치료는 환자의 세포에 치료용 유전자를 전달하는 것을 목표로 합니다. 이 새로운 유전자의 산물은 결핍된 내인성 유전자에서 누락된 활성을 대체하거나, 독성 유전자를 억제하거나, 암세포를 죽이거나, 다른 유익한 기능을 제공할 수 있습니다.

중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 질환의 경우, 유전자 치료 벡터를 표적 조직에 직접 전달하는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 비체계적 접근법은 두 가지 이점을 제공합니다: 말초 transduction에 의해 야기될 수 있는 off-target 부작용을 최소화하고, target tissue에서 적절한 수준의 transduction을 달성하는 데 필요한 벡터의 양을 크게 줄입니다⁵.

유전자 치료 벡터를 중추신경계에 전달하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 벡터를 척수 또는 뇌 조직에 직접 주입하는 실질내 주사는 정의된 영역으로 전달하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나 많은 질병의 경우 중추신경계의 광범위한 전달이 필요합니다. 이는 뇌와 척수 안팎을 흐르는 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)⁵에 벡터를 전달하여 달성할 수 있습니다. CSF에 벡터를 전달하는 세 가지 주요 방법이 있습니다. 가장 침습적인 접근법은 뇌내주사 전달로, 두개골을 통해 버 구멍을 뚫고 뇌를 통해 측심실로 바늘을 전진시키는 것입니다. 이것은 뇌 전체에 형질전환을 일으킨다. 그러나, 이 시술은 두개내 출혈을 유발할 수 있으며, 이 접근법은 일반적으로 척수의 제한된 형질도입만을 생성한다⁶. 두개골 기저부에 있는 수조에 주입하는 것은 덜 침습적이지만 뇌간에 손상을 줄 위험이 있습니다. 동물^{연구에서 자주} 사용되지만5, 수조 마그나(cisterna magna)에 주입하는 것은 더 이상 클리닉에서 일상적으로 사용되지 않는다⁷. 요추 천자는 뇌척수액에 접근하기 위한 가장 덜 침습적인 접근 방식입니다. 이것은 두 개의 요추 사이에 바늘을 삽입하고 요추 수조에 넣는 것을 포함합니다.

벡터 전달을 위한 요추 천자는 성인 쥐와 마우스 및 신생아 마우스에서 일상적으로 수행된다 ^8,9. 이 연구의 저자들은 최근 어린 쥐(생후 28-30일)에서 요추 천자를 수행하여 아데노 관련 바이러스 혈청형 9(AAV9) 벡터를 전달했습니다. 성체 쥐에서, 신생아 요추 천자 바늘을 L3 및 L4 척추⁹ 사이에 수직으로 배치하였다. 적절하게 배치하면 꼬리가 튕기고 CSF가 바늘 저장소로 흘러 들어갑니다. 하지만 어린 쥐에서는 이러한 판독 결과 중 어느 것도 달성되지 않았습니다. 그런 다음 저자들은 L5와 L6¹⁰ 사이의 각도로 삽입된 27G 인슐린 주사기를 사용하여 성체 마우스 절차를 적용하려고 시도했습니다. 일반적으로 P28 쥐보다 작은 성체 마우스에서는 꼬리 튕김이 발생하지 않지만 주사액의 역류로 인해 잘못된 바늘 배치가 분명합니다. 그러나 어린 쥐에서는 이러한 접근 방식이 균일하게 주사액이 경막외 투여되도록 유도했는데, 이는 성체 쥐와 어린 쥐 사이의 척수를 둘러싼 조직층의 탄성이 다르기 때문일 수 있습니다. 다음으로 카테터 접근법을 평가했습니다. 구체적으로, 카테터는 요추 수조의 경막의 절개를 통해 중앙 흉부 척수까지 도입되었습니다. 그러나 이 접근법은 분만 중 주사액이 절개 부위 밖으로 상당히 역류하는 결과를 낳았습니다. 가이드 바늘을 사용하여 경피적으로 카테터를 척수강 내 공간에 삽입하려는 시도도 성공하지 못했습니다. 층간 폭이 좁기 때문에 카테터가 로스트랄 층에 부딪혀 전진하지 못할 가능성이 높습니다.

여기에서, 어린 쥐에서 요추 천자를 통해 성공적이고 재현 가능한 용액 전달을 달성하기 위한 방법이 설명됩니다. 이 접근법은 바이러스 벡터에 사용할 수 있으며 세포, 의약품 및 기타 치료제에도 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 에모리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 Sprague-Dawley 쥐(생후 28-30일, 약 90-135g 범위의 질량, 수컷 및 암컷)를 사용했습니다.

1. 벡터의 준비

1. 절차를 시작할 때 AAV9 벡터( 재료 표 참조)를 얼음에서 해동합니다.
2. 벡터가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 탁상형 원심분리기에서 잠시 원심분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다.
3. 미세 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 용액이 잘 혼합되도록 합니다.

2. 회수 케이지의 준비

1. 깨끗한 케이지를 전기 담요 위에 놓고( 재료 표 참조) 케이지의 절반만 담요와 접촉하도록 합니다.
2. 담요의 온도를 ~37°C로 설정합니다.

3. 수술 플랫폼의 준비

1. 등온 패드( 재료 표 참조)를 전자레인지나 수조에서 39°C로 데우면 내용물이 액체가 됩니다.
2. 등온 패드를 수술 플랫폼에 놓고 깨끗한 흡수성 벤치 패드로 덮습니다.

4. 동물 준비

1. 투명한 상자에 담긴 이소플루란으로 쥐를 마취합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 5% 이소플루란을 사용하여 마취 유도를 시작하고 2%에 도달할 때까지 분당 1%씩 단계적으로 내려갑니다. 추가로 3분 동안 동물을 2%로 유지합니다.
2. 동물이 들어 있는 상자를 흄 후드로 옮기고 상자를 엽니다.
   참고: 이것은 외과의가 마취제에 노출되는 것을 제한합니다.
3. 전기 이발기를 사용하여 동물의 뒤쪽에서 털을 제거하십시오.
   알림: 또는 제모 크림 또는 수동 면도기 및 면도 크림을 사용할 수 있습니다.
4. 마취 코뿔에 주둥이를 놓고 동물을 수술 플랫폼에 놓습니다.
   참고: 수술 부위에서 털을 제거하는 동안 동물은 의식을 회복하기 시작할 수 있습니다. 이 경우 위에서 설명한 대로 다시 마취하십시오.
5. 시술 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 각 눈에 윤활 눈 연고를 바르십시오.
6. 포비돈-요오드와 이소프로판올 물티슈를 번갈아 가며 사용하여 수술 부위를 소독합니다.
7. 진통제를 피하로 주사합니다.
   참고: 부프레노르핀은 일반적으로 0.01-0.05mg/kg의 용량으로 사용되며 12시간마다 제공됩니다. 양자택일로, 이 약의 느리 방출 모양은 1 mg/kg에 72 시간 동안 충분한 고통 통제를 제공하기 위하여 1 번 주어질 수 있습니다. 통증 관리에 관한 지침에 대해 해당 기관의 IACUC와 상의하십시오.
8. 100 μL의 1% 리도카인을 L2 - L6 가시돌기 위에 피하로 주사하여 국소 마취를 제공합니다.
9. 종이 타월 롤이나 지름 1.5cm의 튜브를 동물 아래에 놓고 엉덩이까지 오게하십시오. 이렇게 하면 척추를 구부려 두 층판 사이에 바늘을 더 쉽게 삽입할 수 있습니다.
10. 창호가 있는 드레이프( 재료 표 참조)를 동물에 놓고 창호를 요추 위의 중앙에 놓습니다.

5. 요추 노출

1. 동물의 각 발을 꼬집고 금단 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인합니다.
2. #11 메스 칼날을 사용하여 L2에서 L6까지 정중선을 따라 피부에 약 3cm 길이의 절개를 만듭니다.
3. 근육과 피부 사이에 멸균 곡선형 수술용 가위를 삽입한 다음 끝부분을 열어 근육에서 피부를 풉니다.
4. L2-L5 가시돌기를 덮고 있는 근막을 제거합니다.

6. 주사기 장전

1. 벡터의 25-35 μL(원하는 용량을 얻기 위해)를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브의 캡에 피펫팅합니다.
2. 전체 부피를 인슐린 주사기에 넣습니다.
   알림: 이 과정에서 공기를 흡입하지 않도록 주의하십시오.

7. 주입 수행

1. L5 및 L4 가시돌기를 식별합니다.
   참고: L6은 두 개의 장골 능선 사이에 직접 위치하며, 그 가시 돌기는 뭉툭한 도구로 조사하여 쉽게 식별할 수 있어야 합니다. 그런 다음 기기를 뒤쪽으로 부드럽게 올려 L5 및 L4 프로세스의 경계를 찾을 수 있습니다.
2. 엄지손가락이 동물의 꼬리와 한쪽 다리에 부드럽게 닿도록 한 손을 놓습니다. 손가락을 사용하여 주사기를 고정합니다.
3. 주사기의 바늘을 L5 가시돌기의 왼쪽에 있고 꼬리 끝과 일직선이 되도록 배치합니다. 주사기가 정중선에서 약 30°, 테이블 평면에서 30° 위로 향하도록 배치합니다.
   알림: 랜드마크를 더 잘 식별하고 바늘 끝의 위치를 지정하기 위해 수술용 현미경을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
4. 주사 바늘을 L5 라미나 상단 위로 약 8mm 앞으로 전진시킨 다음 L4 라미나 아래로 요추 수조로 뼈가 부딪힐 때까지 전진시킵니다. 올바르게 배치하면 다리 및/또는 꼬리가 경련되어 다리/꼬리에 놓인 엄지손가락으로 보거나 느낄 수 있습니다. 경련이 없으면 바늘을 제거하고 왼쪽에서 시술을 시도하십시오. 그래도 경련이 없으면 필요에 따라 L4/L3와 L3/L2 사이에서 절차를 반복합니다.
5. 플런저를 약 5초 동안 천천히 누릅니다.
   알림: 주사 중 다리나 꼬리에 경련이 있을 수 있습니다.
6. 플런저를 완전히 누른 후 약 30초 동안 주사기를 제자리에 유지하여 압력이 평형을 이루도록 하고 바늘을 빼낼 때 주입액의 역류를 최소화합니다.
7. 바늘을 천천히 제거하십시오.

8. 절개 부위의 봉합

1. 절개 부위의 가장자리를 근사화합니다.
2. 상처의 한쪽 끝에서 시작하여 4-0 봉합사( 재료 표 참조) 또는 수술용 스테이플을 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.

9. 복구 및 모니터링

1. 미리 데워진 케이지에 동물을 넣으십시오.
2. 완전히 보행할 수 있을 때까지 최소 15분마다 동물을 확인하십시오.
   참고: 15분에서 45분 정도 소요됩니다.
3. 다음 3일 동안은 적어도 매일 건강 검진을 실시하십시오. 수술 후 처음 2일 동안 또는 IACUC의 요구에 따라 진통제를 제공합니다.
4. 수술 후 일주일 후에 봉합사나 스테이플을 제거합니다.

10. 사후 관리 절차

참고: 주입 기술의 정확성을 확인하려면 위에서 설명한 대로 트리판 블루 염료를 주입한 다음 동물을 즉시 안락사시키고(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라) 후궁 절제술을 수행하여 결과를 시각화합니다.

1. 동물이 마취 상태에 있는 동안에는 150mg/kg의 복강 내 주사를 통해 치사량의 펜토바르비탈을 투여하여 안락사시킵니다.
2. 호흡과 심장 활동이 멈추면 흉강을 열어 사망을 보장합니다. 수술 절개 부위를 뒤쪽에서 목까지 확장합니다.
3. 가시돌기의 양쪽에서 척추와 평행한 근육을 4cm 길이로 절개하여 가시돌기에 최대한 가깝게 유지합니다.
4. 가는 집게나 가위를 사용하여 가시돌기 사이의 근육을 제거합니다.
5. rongeur를 사용하여 L6에서 하부 흉추까지의 가시 돌기를 제거합니다( 재료 표 참조). 비틀는 동작은 rongeurs를 손상시킬 수 있으므로 피하십시오.
6. 롱게르의 아래쪽 끝부분을 L5 라미나 아래에 삽입하고 척수 위에 있는 뼈를 여러 번 "물기"를 제거하여 제거합니다.
   참고: L6 가시돌기를 뒤로 당기면 롱게르의 끝부분을 더 쉽게 삽입할 수 있습니다. 척수가 손상되지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
7. 후궁 절제술을 계속 확장하여 적어도 4 개의 라미네를 rostrally. 라미네의 내부 표면에 주입 실패를 나타낼 수 있는 염료의 흔적이 있는지 검사합니다.

결과

주입 기술의 정확성을 결정하기 위해, 염료인 트리판 블루(trypan blue)를 치료제의 대리물로 사용하였다. 이 염료는 단백질에 쉽게 결합하므로 일반적으로 주입된 구조 내에 머뭅니다. 이는 염료가 치료제의 주사 후 분포를 정확하게 예측하지 못할 수 있음을 의미합니다. 단순히 주입의 정확도를 밝히는 데 사용됩니다. 요추 수조에 성공적으로 주입되면 트리판 블루가 경막에 결합하여 척수 주변을 ...

토론

다양한 질병이 중추신경계에 영향을 미칩니다. 바이러스 벡터를 통해 관련 유전자의 기능적 사본을 제공하는 것은 척수성 근위축증과 같이 본질적으로 열성 및 단일 유전자 질환에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 혈액-뇌 장벽(BBB)은 정맥 주사로 투여되는 대부분의 유전자 치료 벡터를 제외합니다¹¹. AAV9와 같이 BBB를 통과할 수 있는 것들은 말초 transduction으로 인한 벡터 손실?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection