Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

요약

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

초록

유전자 치료는 기능적 유전자를 도입하거나, 독성 유전자를 비활성화하거나, 질병의 생물학적 특성을 조절할 수 있는 유전자를 제공하는 등 질병 치료를 위해 환자에게 새로운 유전자를 전달하는 강력한 기술입니다. 치료 벡터에 대한 전달 방법은 전신 전달을 위한 정맥 주입에서 표적 조직에 직접 주입에 이르기까지 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환의 경우, 뇌 및/또는 척수 쪽으로 transduction을 치우는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 전체 중추신경계를 표적으로 하는 최소 침습적 접근법은 뇌척수액(CSF)에 주사하여 치료제가 중추신경계의 많은 부분에 도달할 수 있도록 하는 것입니다. 뇌척수액에 벡터를 전달하는 가장 안전한 방법은 척수의 요추 수조에 바늘을 삽입하는 요추 척수강내 주사입니다. 요추 천자라고도 하는 이 기술은 신생아 및 성인 설치류와 대형 동물 모델에 널리 사용되었습니다. 이 기술은 종과 발달 단계에 따라 유사하지만 척수강내 공간을 둘러싼 조직의 크기, 구조 및 탄성의 미묘한 차이로 인해 접근 방식에 적응이 필요합니다. 이 기사에서는 아데노 관련 혈청형 9 벡터를 전달하기 위해 어린 쥐에서 요추 천자를 수행하는 방법을 설명합니다. 여기에서 25-35 μL의 벡터를 요추 수조에 주입하고 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 사용하여 각 주입으로 인한 transduction profile을 평가했습니다. 이 접근 방식의 이점과 과제에 대해 설명합니다.

서문

바이러스 매개 유전자 치료의 가능성은 최근 몇 년 동안 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 인자 IX 혈우병, 암 등에 대한 치료법에 대한 FDA 승인으로 마침내 실현되었습니다 1,2,3,4. 현재 수많은 다른 치료법이 개발 중입니다. 유전자 치료는 환자의 세포에 치료용 유전자를 전달하는 것을 목표로 합니다. 이 새로운 유전자의 산물은 결핍된 내인성 유전자에서 누락된 활성을 대체하거나, 독성 유전자를 억제하거나, 암세포를 죽이거나, 다른 유익한 기능을 제공할 수 있습니다.

중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 질환의 경우, 유전자 치료 벡터를 표적 조직에 직접 전달하는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 비체계적 접근법은 두 가지 이점을 제공합니다: 말초 transduction에 의해 야기될 수 있는 off-target 부작용을 최소화하고, target tissue에서 적절한 수준의 transduction을 달성하는 데 필요한 벡터의 양을 크게 줄입니다⁵.

프로토콜

이 연구는 에모리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 Sprague-Dawley 쥐(생후 28-30일, 약 90-135g 범위의 질량, 수컷 및 암컷)를 사용했습니다.

1. 벡터의 준비

1. 절차를 시작할 때 AAV9 벡터( 재료 표 참조)를 얼음에서 해동합니다.
2. 벡터가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 탁상형 원심분리기에서 잠시 원심분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다.
3. 미세 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 용액이 잘 혼합되도록 합니다.

2. 회수 케이지의 준비

1. 깨끗한 케이지를 전기 담요 위에 놓고( 재료 표 참조) 케이지의 절반만 담요와 접촉하도록 합니다.
2. 담요의 온도를 ~37°C로 설정합니다.

3. 수술 플랫폼의 준비

1. 등온 패드( 재료 표 참조)를 전자레인지나 수조에서 39°....

토론

다양한 질병이 중추신경계에 영향을 미칩니다. 바이러스 벡터를 통해 관련 유전자의 기능적 사본을 제공하는 것은 척수성 근위축증과 같이 본질적으로 열성 및 단일 유전자 질환에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 혈액-뇌 장벽(BBB)은 정맥 주사로 투여되는 대부분의 유전자 치료 벡터를 제외합니다¹¹. AAV9와 같이 BBB를 통과할 수 있는 것들은 말초 transduction으로 인한 벡터 손실?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection