Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Riepilogo

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Abstract

La terapia genica è una potente tecnologia per fornire nuovi geni a un paziente per il trattamento della malattia, sia per introdurre un gene funzionale, inattivare un gene tossico o fornire un gene il cui prodotto può modulare la biologia della malattia. Il metodo di somministrazione del vettore terapeutico può assumere molte forme, che vanno dall'infusione endovenosa per la somministrazione sistemica all'iniezione diretta nel tessuto bersaglio. Per le malattie neurodegenerative, è spesso auspicabile inclinare la trasduzione verso il cervello e/o il midollo spinale. L'approccio meno invasivo per colpire l'intero sistema nervoso centrale prevede l'iniezione nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo alla terapia di raggiungere un'ampia frazione del sistema nervoso centrale. L'approccio più sicuro per rilasciare un vettore nel liquido cerebrospinale è l'iniezione intratecale lombare, in cui un ago viene introdotto nella cisterna lombare del midollo spinale. Questa tecnica, nota anche come puntura lombare, è stata ampiamente utilizzata nei roditori neonatali e adulti e nei modelli animali di grandi dimensioni. Sebbene la tecnica sia simile tra le specie e gli stadi di sviluppo, sottili differenze nelle dimensioni, nella struttura e nell'elasticità dei tessuti che circondano lo spazio intratecale richiedono sistemazioni nell'approccio. Questo articolo descrive un metodo per eseguire la puntura lombare nei ratti giovani per fornire un vettore del sierotipo 9 adeno-associato. Qui, 25-35 μL di vettore sono stati iniettati nella cisterna lombare e un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per valutare il profilo di trasduzione risultante da ciascuna iniezione. Vengono discussi i vantaggi e le sfide di questo approccio.

Introduzione

La promessa delle terapie geniche mediate da virus è stata finalmente realizzata negli ultimi anni con l'approvazione da parte della FDA di trattamenti per l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica, l'emofilia del fattore IX, il cancro ^{e altro ancora}. Innumerevoli altre terapie sono attualmente in fase di sviluppo. La terapia genica mira a fornire un gene terapeutico alle cellule di un paziente. I prodotti di questo nuovo gene possono sostituire l'attività mancante di un gene endogeno carente, inibire un gene tossico, uccidere le cellule cancerose o fornire qualche altra funzione benefica.

Per le malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC), è spesso auspicabile somministrare il vettore della terapia genica direttamente al tessuto bersaglio. Gli approcci non sistemici offrono due vantaggi: riducono al minimo gli effetti collaterali fuori bersaglio che possono essere causati dalla trasduzione periferica e riducono notevolmente la quantità di vettore necessaria per raggiungere livelli adeguati di trasduzione nel tessuto bersaglio⁵.

Esistono diversi approcci per fornire vettori di terapia genica al SNC. L'iniezione intraparenchimale, l'iniezione di un vettore direttamente nel midollo spinale o nel tessuto cerebrale, può essere utilizzata per la consegna in una regione definita. Tuttavia, per molte malattie, è auspicabile un'ampia trasduzione del SNC. Ciò può essere ottenuto fornendo un vettore al liquido cerebrospinale (CSF)⁵, il fluido che scorre dentro e intorno al cervello e al midollo spinale. Esistono tre modi principali per fornire vettori al CSF. L'approccio più invasivo è la somministrazione intracerebroventricolare, che prevede la perforazione di un foro attraverso il cranio e l'avanzamento di un ago attraverso il cervello nei ventricoli laterali. Questo produce la trasduzione in tutto il cervello. Tuttavia, la procedura può causare emorragia intracranica e l'approccio generalmente produce solo una trasduzione limitata del midollo spinale⁶. L'iniezione nella cisterna magna alla base del cranio è meno invasiva, ma comporta il rischio di danni al tronco encefalico. Sebbene sia spesso utilizzata nella ricerca sugli animali⁵, l'iniezione nella cisterna magna non viene più utilizzata di routine in clinica⁷. La puntura lombare è l'approccio meno invasivo per accedere al liquido cerebrospinale. Ciò comporta il posizionamento di un ago tra due vertebre lombari e nella cassetta lombare.

La puntura lombare per la somministrazione del vettore viene eseguita di routine nei ratti e nei topi adulti e nei topi neonatali ^8,9. Gli autori di questo studio hanno recentemente eseguito punture lombari in ratti giovani (28-30 giorni di età) per fornire vettori del sierotipo 9 del virus adeno-associato (AAV9). Nei ratti adulti, un ago per puntura lombare neonatale è stato posizionato verticalmente tra le vertebre L3 e L4⁹. Il corretto posizionamento provoca un movimento della coda e un liquido cerebrospinale che scorre nel serbatoio dell'ago. Nei ratti giovani, tuttavia, non è stato possibile ottenere nessuna di queste letture. Gli autori hanno quindi tentato di adattare una procedura su un topo adulto utilizzando una siringa da insulina da 27 G inserita con un angolo compreso tra L5 e L6¹⁰. Nei topi adulti, che sono in genere più piccoli dei ratti P28, questo non produce un movimento della coda, ma il posizionamento errato dell'ago è evidente dal riflusso dell'iniettato. Nei ratti giovani, tuttavia, questo approccio ha portato uniformemente alla somministrazione dell'iniettato per via epidurale, probabilmente a causa della diversa elasticità tra i topi adulti e i ratti giovani degli strati di tessuto che circondano il midollo spinale. Successivamente sono stati valutati gli approcci al catetere. Nello specifico, un catetere è stato introdotto attraverso un'incisione nella dura della cisterna lombare e fino al midollo spinale medio-toracico; Tuttavia, questo approccio ha portato a un sostanziale reflusso dell'iniettato fuori dal sito di incisione durante il parto. Anche i tentativi di posizionare il catetere nello spazio intratecale per via percutanea utilizzando un ago guida non hanno avuto successo. A causa della ristrettezza della larghezza interlaminare, il catetere probabilmente colpirebbe la lamina rostrale e non riuscirebbe ad avanzare.

Qui, viene descritto un metodo per ottenere una somministrazione di soluzione efficace e riproducibile tramite una puntura lombare nel ratto giovane. Questo approccio può essere utilizzato per vettori virali e probabilmente anche per cellule, prodotti farmaceutici e altre terapie.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Emory University (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (28-30 giorni di età, massa nell'intervallo di circa 90-135 g, maschi e femmine).

1. Preparazione del vettore

1. Scongelare il vettore AAV9 (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio all'inizio della procedura.
2. Centrifugare brevemente la provetta per microcentrifuga contenente il vettore in una centrifuga da tavolo per assicurarsi che tutto il liquido si trovi sul fondo della provetta.
3. Agitare delicatamente la provetta per microcentrifuga per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.

2. Preparazione della gabbia di recupero

1. Posizionare una gabbia pulita su una coperta elettrica (vedi Tabella dei materiali) in modo che solo metà della gabbia sia a contatto con la coperta.
2. Impostare la temperatura della coperta a ~37 °C.

3. Preparazione della piattaforma chirurgica

1. Scaldare un tampone isotermico (vedi Tabella dei materiali) a 39 °C in un forno a microonde o a bagnomaria in modo che il contenuto diventi liquido.
2. Posizionare il tampone isotermico sulla piattaforma chirurgica e coprirlo con un tampone assorbente pulito.

4. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare i ratti con isoflurano in una scatola trasparente (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Iniziare l'induzione dell'anestesia utilizzando isoflurano al 5% e diminuire dell'1% al minuto fino a raggiungere il 2%. Tenere l'animale al 2% per altri 3 minuti.
2. Sposta la scatola che tiene l'animale su una cappa aspirante e apri la scatola.
   NOTA: Questo limita l'esposizione del chirurgo all'anestetico.
3. Rimuovere i peli dalla parte posteriore dell'animale utilizzando un tagliacapelli elettrico.
   NOTA: In alternativa è possibile utilizzare una crema depilatoria o un rasoio manuale e una crema da barba.
4. Posizionare l'animale sulla piattaforma chirurgica con il muso nel cono del naso per anestesia.
   NOTA: L'animale può iniziare a riprendere conoscenza mentre il pelo viene rimosso dal sito chirurgico. Se ciò accade, anestetizzarlo nuovamente come descritto sopra.
5. Applicare un unguento lubrificante su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione delle cornee durante la procedura.
6. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando tre applicazioni alternate di salviette iodio povidone e isopropanolo.
7. Iniettare l'analgesico per via sottocutanea.
   NOTA: La buprenorfina viene generalmente utilizzata alla dose di 0,01-0,05 mg/kg, somministrata ogni 12 ore. In alternativa, una forma a lento rilascio di questo farmaco può essere somministrata una volta a 1 mg/kg per fornire un adeguato controllo del dolore per 72 ore. Consultare l'IACUC dell'istituto per le loro linee guida in merito alla gestione del dolore.
8. Iniettare 100 μl di lidocaina all'1% per via sottocutanea sopra i processi spinosi da L2 a L6 per fornire l'anestesia locale.
9. Posizionare un rotolo di carta assorbente o un tubo di 1,5 cm di diametro sotto l'animale, appena rostrale ai fianchi. Questo aiuta a flettere la colonna vertebrale, facilitando l'inserimento dell'ago tra le due lamine.
10. Posizionare un telo fenestrato (vedi Tabella dei materiali) sull'animale, centrando la fenestrazione sulla colonna lombare.

5. Esposizione della colonna lombare

1. Conferma la profondità dell'anestesia pizzicando ciascuna delle zampe dell'animale e cercando l'assenza di una risposta di astinenza.
2. Utilizzando una lama di bisturi #11, creare un'incisione di circa 3 cm di lunghezza nella pelle lungo la linea mediana da L2 a L6.
3. Allenta la pelle dal muscolo inserendo un paio di forbici chirurgiche curve sterili tra il muscolo e la pelle e poi aprendo le punte.
4. Rimuovere la fascia che copre i processi spinosi L2-L5.

6. Caricamento della siringa

1. Pipettare 25-35 μL del vettore (per ottenere la dose desiderata) nel tappo di una provetta sterile per microcentrifuga.
2. Aspirare l'intero volume nella siringa da insulina.
   NOTA: Fare attenzione a non aspirare aria durante questo processo.

7. Esecuzione dell'iniezione

1. Identificare i processi spinosi L5 e L4.
   NOTA: L6 si trova direttamente tra le due creste iliache e il suo processo spinoso dovrebbe essere facile da identificare sondando con uno strumento smussato. Lo strumento può quindi essere fatto scorrere delicatamente sulla schiena per trovare i confini dei processi L5 e L4.
2. Metti una mano in modo che il pollice poggi delicatamente sulla coda e su una gamba dell'animale. Utilizzare un dito per tenere ferma la siringa.
3. Posizionare l'ago della siringa in modo che si trovi a sinistra del processo spinoso L5 e allineato con la sua estremità caudale. Posizionare la siringa in modo che si trovi a circa 30° dalla linea mediana e a 30° dal piano del tavolo.
   NOTA: Può essere utile utilizzare un microscopio operatorio per identificare meglio i punti di riferimento e posizionare la punta dell'ago.
4. Far avanzare l'ago della siringa in avanti di circa 8 mm, sopra la parte superiore della lamina L5 e poi sotto la lamina L4 nella cassetta lombare fino a quando l'osso non viene colpito. Il posizionamento corretto provocherà una contrazione della gamba e/o della coda che può essere vista o sentita dal pollice appoggiato sulla gamba/coda. Se non ci sono contrazioni, rimuovere l'ago e tentare la procedura dal lato sinistro. Se non ci sono ancora contrazioni, ripetere la procedura tra L4/L3 e L3/L2 se necessario.
5. Premere lentamente lo stantuffo per circa 5 s.
   NOTA: Durante l'iniezione potrebbe verificarsi una contrazione della gamba o della coda.
6. Tenere la siringa in posizione per circa 30 secondi dopo aver premuto completamente lo stantuffo per consentire alla pressione di equilibrarsi e ridurre al minimo il reflusso dell'iniettato quando l'ago viene estratto.
7. Rimuovere lentamente l'ago.

8. Chiusura dell'incisione

1. Approssimare i bordi dell'incisione.
2. Iniziando da un'estremità della ferita, utilizzare una sutura 4-0 (vedi Tabella dei materiali) o graffette chirurgiche per chiudere l'incisione.

9. Recupero e monitoraggio

1. Metti l'animale nella gabbia preriscaldata.
2. Controllare l'animale almeno ogni 15 minuti fino a quando non è completamente deambulante.
   NOTA: Questo dovrebbe richiedere tra 15 minuti e 45 minuti.
3. Per i prossimi tre giorni, eseguire controlli di benessere almeno una volta al giorno. Fornire analgesici per i primi 2 giorni dopo l'intervento chirurgico o come richiesto dall'IACUC.
4. Una settimana dopo l'intervento, rimuovere i punti di sutura o le graffette.

10. Procedura di follow-up

NOTA: Per determinare l'accuratezza della tecnica di iniezione, iniettare il colorante blu di tripano come descritto sopra e quindi sopprimere immediatamente l'animale (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente) ed eseguire una laminectomia per visualizzare il risultato.

1. Mentre l'animale rimane sotto anestesia, sopprimerlo somministrando una dose letale di pentobarbital tramite iniezione intraperitoneale alla dose di 150 mg/kg.
2. Una volta cessata la respirazione e l'attività cardiaca, aprire la cavità toracica per garantire la morte. Estendere l'incisione chirurgica lungo la schiena fino al collo.
3. Praticare un'incisione lunga 4 cm nel muscolo parallelo alla colonna vertebrale su entrambi i lati dei processi spinosi, mantenendosi il più vicino possibile ai processi.
4. Usando una pinza fine o le forbici, rimuovi il muscolo tra i processi spinosi.
5. Rimuovere i processi spinosi da L6 fino alla colonna vertebrale toracica inferiore utilizzando un rongeur (vedi Tabella dei materiali). Evitare movimenti di torsione, in quanto ciò potrebbe danneggiare i rongeur.
6. Inserire la punta inferiore del rongeur sotto la lamina L5 e rimuovere l'osso sovrastante il midollo spinale prelevando diversi "morsi" da esso.
   NOTA: Tirare indietro il processo spinoso L6 può facilitare l'inserimento della punta del rongeur. È necessario prestare attenzione per evitare danni al midollo spinale.
7. Continuare ad espandere la laminectomia almeno quattro lamine rostralmente. Ispezionare la superficie interna delle lamine per segni di colorante, che possono indicare un'iniezione fallita.

Risultati

Per determinare l'accuratezza della tecnica di iniezione, è stato utilizzato un colorante, il blu di tripano, come surrogato della terapia. Questo colorante si lega facilmente alle proteine, quindi generalmente rimane all'interno della struttura in cui è stato iniettato. Ciò significa che il colorante potrebbe non prevedere con precisione la distribuzione post-iniezione della terapia; Viene semplicemente utilizzato per rivelare l'accuratezza dell'iniezione. Quando viene introdotto con successo nella cisterna lombare, ...

Discussione

Un'ampia varietà di malattie colpisce il SNC. Fornire una copia funzionale del gene pertinente tramite un vettore virale è una strategia di trattamento interessante per coloro che sono di natura recessiva e monogenica, come l'atrofia muscolare spinale. Tuttavia, la barriera emato-encefalica (BEE) esclude la maggior parte dei vettori di terapia genica somministrati per via endovenosa¹¹. Quelli che possono attraversare la BEE, come l'AAV9, devono essere somministrati in dosi elevate per superare l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection