Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Riepilogo

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Abstract

La terapia genica è una potente tecnologia per fornire nuovi geni a un paziente per il trattamento della malattia, sia per introdurre un gene funzionale, inattivare un gene tossico o fornire un gene il cui prodotto può modulare la biologia della malattia. Il metodo di somministrazione del vettore terapeutico può assumere molte forme, che vanno dall'infusione endovenosa per la somministrazione sistemica all'iniezione diretta nel tessuto bersaglio. Per le malattie neurodegenerative, è spesso auspicabile inclinare la trasduzione verso il cervello e/o il midollo spinale. L'approccio meno invasivo per colpire l'intero sistema nervoso centrale prevede l'iniezione nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo alla terapia di raggiungere un'ampia frazione del sistema nervoso centrale. L'approccio più sicuro per rilasciare un vettore nel liquido cerebrospinale è l'iniezione intratecale lombare, in cui un ago viene introdotto nella cisterna lombare del midollo spinale. Questa tecnica, nota anche come puntura lombare, è stata ampiamente utilizzata nei roditori neonatali e adulti e nei modelli animali di grandi dimensioni. Sebbene la tecnica sia simile tra le specie e gli stadi di sviluppo, sottili differenze nelle dimensioni, nella struttura e nell'elasticità dei tessuti che circondano lo spazio intratecale richiedono sistemazioni nell'approccio. Questo articolo descrive un metodo per eseguire la puntura lombare nei ratti giovani per fornire un vettore del sierotipo 9 adeno-associato. Qui, 25-35 μL di vettore sono stati iniettati nella cisterna lombare e un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per valutare il profilo di trasduzione risultante da ciascuna iniezione. Vengono discussi i vantaggi e le sfide di questo approccio.

Introduzione

La promessa delle terapie geniche mediate da virus è stata finalmente realizzata negli ultimi anni con l'approvazione da parte della FDA di trattamenti per l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica, l'emofilia del fattore IX, il cancro ^{e altro ancora}. Innumerevoli altre terapie sono attualmente in fase di sviluppo. La terapia genica mira a fornire un gene terapeutico alle cellule di un paziente. I prodotti di questo nuovo gene possono sostituire l'attività mancante di un gene endogeno carente, inibire un gene tossico, uccidere le ce....

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Emory University (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (28-30 giorni di età, massa nell'intervallo di circa 90-135 g, maschi e femmine).

1. Preparazione del vettore

1. Scongelare il vettore AAV9 (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio all'inizio della procedura.
2. Centrifugare brevemente la provetta per microcentrifuga contenente il vettore in una centrifuga da tavolo per assicurarsi che tutto il liquido si trovi sul fondo della provetta.
3. Agitare deli....

Discussione

Un'ampia varietà di malattie colpisce il SNC. Fornire una copia funzionale del gene pertinente tramite un vettore virale è una strategia di trattamento interessante per coloro che sono di natura recessiva e monogenica, come l'atrofia muscolare spinale. Tuttavia, la barriera emato-encefalica (BEE) esclude la maggior parte dei vettori di terapia genica somministrati per via endovenosa¹¹. Quelli che possono attraversare la BEE, come l'AAV9, devono essere somministrati in dosi elevate per superare l.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection