Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Zusammenfassung

Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Die Gentherapie ist eine leistungsstarke Technologie, um einem Patienten neue Gene zur Behandlung einer Krankheit zuzuführen, sei es zur Einführung eines funktionellen Gens, zur Inaktivierung eines toxischen Gens oder zur Bereitstellung eines Gens, dessen Produkt die Biologie der Krankheit modulieren kann. Die Verabreichungsmethode für den therapeutischen Vektor kann viele Formen annehmen, die von der intravenösen Infusion zur systemischen Verabreichung bis zur direkten Injektion in das Zielgewebe reichen. Bei neurodegenerativen Erkrankungen ist es oft wünschenswert, die Transduktion in Richtung Gehirn und/oder Rückenmark zu verzerren. Der am wenigsten invasive Ansatz, der auf das gesamte Zentralnervensystem abzielt, ist die Injektion in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), wodurch das Therapeutikum einen großen Teil des Zentralnervensystems erreichen kann. Der sicherste Ansatz, einen Vektor in den Liquor zu verabreichen, ist die lumbale intrathekale Injektion, bei der eine Nadel in die lumbale Zisterne des Rückenmarks eingeführt wird. Diese Technik, die auch als Lumbalpunktion bekannt ist, wurde häufig bei Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren sowie in Großtiermodellen eingesetzt. Während die Technik über alle Spezies und Entwicklungsstadien hinweg ähnlich ist, erfordern subtile Unterschiede in Größe, Struktur und Elastizität des Gewebes, das den intrathekalen Raum umgibt, Anpassungen im Ansatz. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Durchführung einer Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten beschrieben, um einen Adeno-assoziierten Serotyp-9-Vektor zu verabreichen. Hier wurden 25-35 μl Vektor in die lumbale Zisterne injiziert, und ein grün fluoreszierender Protein-Reporter (GFP) wurde verwendet, um das Transduktionsprofil zu bewerten, das sich aus jeder Injektion ergibt. Die Vorteile und Herausforderungen dieses Ansatzes werden diskutiert.

Einleitung

Das Versprechen viral vermittelter Gentherapien wurde in den letzten Jahren mit der FDA-Zulassung von Behandlungen für spinale Muskelatrophie, Netzhautdystrophie, Faktor-IX-Hämophilie, Krebs und mehr endlich verwirklicht 1,2,3,4. Unzählige weitere Therapeutika befinden sich derzeit in der Entwicklung. Die Gentherapie zielt darauf ab, ein therapeutisches Gen in die Zellen eines Patienten zu bringen. Die Produkte dieses neuen Gens können die fehlende Aktivität eines mangelhaften endogenen Gens ersetzen, ein toxisches Gen hemmen, Krebszellen ab....

Protokoll

Diese Studie wurde vom Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der vorliegenden Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten (28-30 Tage alt, Masse im Bereich von etwa 90-135 g, Männchen und Weibchen) verwendet.

1. Vorbereitung des Vektors

1. Tauen Sie den AAV9-Vektor (siehe Materialtabelle) zu Beginn des Vorgangs auf Eis auf.
2. Zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Vektor kurz in einer Tischzentrifuge, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet.
3. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Mikrozentr....

Diskussion

Das ZNS ist von den unterschiedlichsten Erkrankungen betroffen. Die Bereitstellung einer funktionellen Kopie des relevanten Gens über einen viralen Vektor ist eine attraktive Behandlungsstrategie für solche, die rezessiv und monogen Natur sind, wie z. B. spinale Muskelatrophie. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schließt jedoch die meisten intravenös verabreichten Gentherapievektoren aus¹¹. Diejenigen, die die BHS überwinden können, wie z. B. AAV9, müssen in hohen Dosen verabreicht werden, um den.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection