Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Zusammenfassung

Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Die Gentherapie ist eine leistungsstarke Technologie, um einem Patienten neue Gene zur Behandlung einer Krankheit zuzuführen, sei es zur Einführung eines funktionellen Gens, zur Inaktivierung eines toxischen Gens oder zur Bereitstellung eines Gens, dessen Produkt die Biologie der Krankheit modulieren kann. Die Verabreichungsmethode für den therapeutischen Vektor kann viele Formen annehmen, die von der intravenösen Infusion zur systemischen Verabreichung bis zur direkten Injektion in das Zielgewebe reichen. Bei neurodegenerativen Erkrankungen ist es oft wünschenswert, die Transduktion in Richtung Gehirn und/oder Rückenmark zu verzerren. Der am wenigsten invasive Ansatz, der auf das gesamte Zentralnervensystem abzielt, ist die Injektion in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), wodurch das Therapeutikum einen großen Teil des Zentralnervensystems erreichen kann. Der sicherste Ansatz, einen Vektor in den Liquor zu verabreichen, ist die lumbale intrathekale Injektion, bei der eine Nadel in die lumbale Zisterne des Rückenmarks eingeführt wird. Diese Technik, die auch als Lumbalpunktion bekannt ist, wurde häufig bei Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren sowie in Großtiermodellen eingesetzt. Während die Technik über alle Spezies und Entwicklungsstadien hinweg ähnlich ist, erfordern subtile Unterschiede in Größe, Struktur und Elastizität des Gewebes, das den intrathekalen Raum umgibt, Anpassungen im Ansatz. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Durchführung einer Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten beschrieben, um einen Adeno-assoziierten Serotyp-9-Vektor zu verabreichen. Hier wurden 25-35 μl Vektor in die lumbale Zisterne injiziert, und ein grün fluoreszierender Protein-Reporter (GFP) wurde verwendet, um das Transduktionsprofil zu bewerten, das sich aus jeder Injektion ergibt. Die Vorteile und Herausforderungen dieses Ansatzes werden diskutiert.

Einleitung

Das Versprechen viral vermittelter Gentherapien wurde in den letzten Jahren mit der FDA-Zulassung von Behandlungen für spinale Muskelatrophie, Netzhautdystrophie, Faktor-IX-Hämophilie, Krebs und mehr endlich verwirklicht 1,2,3,4. Unzählige weitere Therapeutika befinden sich derzeit in der Entwicklung. Die Gentherapie zielt darauf ab, ein therapeutisches Gen in die Zellen eines Patienten zu bringen. Die Produkte dieses neuen Gens können die fehlende Aktivität eines mangelhaften endogenen Gens ersetzen, ein toxisches Gen hemmen, Krebszellen abtöten oder eine andere nützliche Funktion erfüllen.

Bei Erkrankungen, die das Zentralnervensystem (ZNS) betreffen, ist es oft wünschenswert, den Gentherapievektor direkt an das Zielgewebe zu verabreichen. Nicht-systemische Ansätze bieten zwei Vorteile: Sie minimieren Off-Target-Nebeneffekte, die durch periphere Transduktion verursacht werden können, und sie reduzieren die Menge an Vektoren, die benötigt wird, um ein angemessenes Transduktionsniveau im Zielgewebe zu erreichen, erheblich⁵.

Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, um Gentherapie-Vektoren an das ZNS zu verabreichen. Die intraparenchymale Injektion, die Injektion eines Vektors direkt in das Rückenmark oder das Hirngewebe, kann zur Verabreichung in eine definierte Region verwendet werden. Bei vielen Erkrankungen ist jedoch eine breite Transduktion des ZNS erwünscht. Dies kann erreicht werden, indem ein Vektor in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF)⁵ abgegeben wird, die Flüssigkeit, die in und um das Gehirn und das Rückenmark fließt. Es gibt drei Hauptmethoden, um Vektoren an das CSF zu liefern. Der invasivste Ansatz ist die intrazerebroventrikuläre Verabreichung, bei der ein Bohrloch durch den Schädel gebohrt und eine Nadel durch das Gehirn in die Seitenventrikel vorgeschoben wird. Dies führt zu einer Transduktion im gesamten Gehirn. Das Verfahren kann jedoch zu intrakraniellen Blutungen führen, und der Ansatz führt in der Regel nur zu einer eingeschränkten Transduktion des Rückenmarks⁶. Die Injektion in die Cisterna magna an der Schädelbasis ist weniger invasiv, birgt aber das Risiko einer Schädigung des Hirnstamms. Während die Injektion in die Cisterna magna in der Tierforschung häufig eingesetzt wird⁵, wird sie in der Klinik nicht mehr routinemäßig angewendet⁷. Die Lumbalpunktion ist der am wenigsten invasive Ansatz für den Zugang zum Liquor. Dabei wird eine Nadel zwischen zwei Lendenwirbeln in den Lendenwirbel eingeführt.

Die Lumbalpunktion zur Vektorverabreichung wird routinemäßig bei adulten Ratten und Mäusen sowie bei neugeborenen Mäusen durchgeführt ^8,9. Die Autoren dieser Studie führten kürzlich Lumbalpunktionen bei juvenilen Ratten (im Alter von 28-30 Tagen) durch, um Adeno-assoziierte Virus-Serotyp 9 (AAV9)-Vektoren zu liefern. Bei erwachsenen Ratten wurde eine Lumbalpunktionsnadel bei Neugeborenen senkrecht zwischen den Wirbeln L3 und L4 platziert⁹. Die richtige Platzierung führt zu einem Schwanzschlag und Liquor fließt in das Nadelreservoir. Bei juvenilen Ratten konnte jedoch keiner dieser Messwerte erreicht werden. Die Autoren versuchten dann, ein Verfahren an eine adulte Maus anzupassen, bei der eine 27-G-Insulinspritze in einem Winkel zwischen L5 und L6 eingeführt wurde¹⁰. Bei erwachsenen Mäusen, die typischerweise kleiner als P28-Ratten sind, führt dies nicht zu einem Schwanzschlag, aber eine falsche Nadelplatzierung ist durch den Rückfluss des Injektats offensichtlich. Bei juvenilen Ratten führte dieser Ansatz jedoch einheitlich dazu, dass das Injektionsmuster epidural verabreicht wurde, was wahrscheinlich auf die unterschiedliche Elastizität der Gewebeschichten, die das Rückenmark umgeben, zwischen adulten Mäusen und juvenilen Ratten zurückzuführen ist. Als nächstes wurden Katheteransätze evaluiert. Konkret wurde ein Katheter durch einen Schnitt in der Dura des lumbalen Spülkastens und bis zum mittleren thorakalen Rückenmark eingeführt; Dieser Ansatz führte jedoch zu einem erheblichen Rückfluss des Injektats aus der Inzisionsstelle während der Verabreichung. Auch Versuche, den Katheter mit einer Führungsnadel perkutan in den intrathekalen Raum zu platzieren, waren erfolglos. Aufgrund der Enge der interlaminaren Breite würde der Katheter wahrscheinlich die rostrale Lamina treffen und nicht vorstoßen.

Hier wird eine Methode beschrieben, um eine erfolgreiche und reproduzierbare Lösungsabgabe über eine Lumbalpunktion bei der juvenilen Ratte zu erreichen. Dieser Ansatz kann für virale Vektoren und wahrscheinlich auch für Zellen, Pharmazeutika und andere Therapeutika verwendet werden.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der vorliegenden Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten (28-30 Tage alt, Masse im Bereich von etwa 90-135 g, Männchen und Weibchen) verwendet.

1. Vorbereitung des Vektors

1. Tauen Sie den AAV9-Vektor (siehe Materialtabelle) zu Beginn des Vorgangs auf Eis auf.
2. Zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Vektor kurz in einer Tischzentrifuge, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet.
3. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt ist.

2. Vorbereitung des Auffangkäfigs

1. Stellen Sie einen sauberen Käfig so auf eine Heizdecke (siehe Materialtabelle), dass nur die Hälfte des Käfigs mit der Decke in Kontakt kommt.
2. Stellen Sie die Temperatur der Decke auf ~37 °C ein.

3. Vorbereitung der chirurgischen Plattform

1. Erwärmen Sie ein isothermes Pad (siehe Materialtabelle) in der Mikrowelle oder im Wasserbad auf 39 °C, so dass der Inhalt flüssig wird.
2. Legen Sie das isotherme Pad auf die Operationsplattform und decken Sie es mit einer sauberen, saugfähigen Bankunterlage ab.

4. Vorbereitung der Tiere

1. Betäuben Sie die Ratten mit Isofluran in einer durchsichtigen Box (nach institutionell anerkannten Protokollen). Beginnen Sie die Anästhesieeinleitung mit 5 % Isofluran und verringern Sie die Anästhesie um 1 % pro Minute, bis Sie 2 % erreichen. Halten Sie das Tier für weitere 3 Minuten bei 2 %.
2. Schieben Sie den Kasten mit dem Tier zu einem Abzug und öffnen Sie den Kasten.
   HINWEIS: Dies begrenzt die Exposition des Chirurgen gegenüber dem Anästhetikum.
3. Entfernen Sie die Haare vom Rücken des Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine.
   HINWEIS: Alternativ kann eine Enthaarungscreme oder ein manueller Rasierer und Rasierschaum verwendet werden.
4. Platzieren Sie das Tier auf der Operationsplattform mit der Schnauze im Anästhesie-Nasenkonus.
   HINWEIS: Das Tier kann beginnen, das Bewusstsein wiederzuerlangen, während das Fell von der Operationsstelle entfernt wird. In diesem Fall betäuben Sie es erneut wie oben beschrieben.
5. Tragen Sie eine befeuchtende Augensalbe auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern.
6. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Anwendungen von Povidon-Jod- und Isopropanol-Tüchern.
7. Injizieren Sie das/die Analgetikum(e) subkutan.
   HINWEIS: Buprenorphin wird im Allgemeinen in einer Dosis von 0,01-0,05 mg/kg alle 12 Stunden verabreicht. Alternativ kann eine langsam freisetzende Form dieses Arzneimittels einmal mit 1 mg/kg verabreicht werden, um eine angemessene Schmerzkontrolle für 72 Stunden zu gewährleisten. Wenden Sie sich an die IACUC der Institution, um deren Richtlinien zur Schmerzbehandlung zu erhalten.
8. Injizieren Sie 100 μl 1 % Lidocain subkutan über den Dornfortsätzen L2 bis L6, um eine Lokalanästhesie durchzuführen.
9. Legen Sie eine Rolle Papiertuch oder eine Röhre mit einem Durchmesser von 1,5 cm unter das Tier, gerade rostral zu den Hüften. Dies hilft, die Wirbelsäule zu beugen, was es einfacher macht, die Nadel zwischen den beiden Lamellen einzuführen.
10. Legen Sie ein Fenstertuch (siehe Materialtabelle) auf das Tier und zentrieren Sie das Fenster über der Lendenwirbelsäule.

5. Freilegung der Lendenwirbelsäule

1. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie jede der Pfoten des Tieres kneifen und darauf achten, ob es keine Entzugsreaktion gibt.
2. Mache mit einer Skalpellklinge #11 einen ca. 3 cm langen Schnitt in der Haut entlang der Mittellinie von L2 bis L6.
3. Lösen Sie die Haut vom Muskel, indem Sie eine steril gebogene chirurgische Schere zwischen Muskel und Haut einführen und dann die Spitzen öffnen.
4. Entfernen Sie die Faszie, die die Dornfortsätze L2-L5 bedeckt.

6. Beladung der Spritze

1. Pipettieren Sie 25-35 μl des Vektors (um die gewünschte Dosis zu erreichen) in den Deckel eines sterilen Mikrozentrifugenröhrchens.
2. Ziehen Sie das gesamte Volumen in die Insulinspritze.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich während dieses Vorgangs keine Luft ansaugt.

7. Durchführung der Injektion

1. Identifizieren Sie die Dornfortsätze L5 und L4.
   HINWEIS: L6 sitzt direkt zwischen den beiden Beckenkämmen, und sein Dornfortsatz sollte durch Sondieren mit einem stumpfen Instrument leicht zu identifizieren sein. Das Instrument kann dann sanft über den Rücken geführt werden, um die Grenzen der Prozesse L5 und L4 zu finden.
2. Legen Sie eine Hand so auf, dass der Daumen sanft auf dem Schwanz und einem Bein des Tieres aufliegt. Verwenden Sie einen Finger, um die Spritze zu fixieren.
3. Positionieren Sie die Nadel der Spritze so, dass sie sich links vom Dornfortsatz L5 befindet und mit seinem kaudalen Ende ausgerichtet ist. Positionieren Sie die Spritze so, dass sie etwa 30° von der Mittellinie und 30° von der Tischebene entfernt ist.
   HINWEIS: Es kann hilfreich sein, ein Operationsmikroskop zu verwenden, um Orientierungspunkte besser zu identifizieren und die Nadelspitze zu positionieren.
4. Schieben Sie die Spritzennadel ca. 8 mm nach vorne, über die Oberseite der L5-Lamina und dann unter der L4-Lamina in die Lendenzisterne, bis der Knochen getroffen wird. Die richtige Platzierung führt zu einem Zucken des Beins und/oder des Schwanzes, das durch den Daumen, der auf dem Bein/Schwanz ruht, gesehen oder gefühlt werden kann. Wenn es nicht zuckt, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie den Vorgang von der linken Seite aus. Wenn immer noch kein Zucken zu hören ist, wiederholen Sie den Vorgang zwischen L4/L3 und L3/L2 nach Bedarf.
5. Drücken Sie den Kolben langsam für ca. 5 s.
   HINWEIS: Während der Injektion kann es zu einem Zucken im Bein oder Schwanz kommen.
6. Halten Sie die Spritze nach dem vollständigen Drücken des Kolbens etwa 30 s lang an Ort und Stelle, damit sich der Druck ausgleichen kann und der Rückfluss des Injektats beim Zurückziehen der Nadel minimiert wird.
7. Entfernen Sie langsam die Nadel.

8. Verschluss des Schnittes

1. Nähern Sie sich den Rändern des Schnitts.
2. Beginnen Sie an einem Ende der Wunde und verwenden Sie eine 4-0-Naht (siehe Materialtabelle) oder chirurgische Klammern, um den Schnitt zu schließen.

9. Wiederherstellung und Überwachung

1. Setzen Sie das Tier in den vorgewärmten Käfig.
2. Kontrollieren Sie das Tier mindestens alle 15 Minuten, bis es vollständig gehfähig ist.
   HINWEIS: Dies sollte zwischen 15 Minuten und 45 Minuten dauern.
3. Führen Sie in den nächsten drei Tagen mindestens täglich Gesundheitschecks durch. Geben Sie Analgetika für die ersten 2 Tage nach der Operation oder wie von der IACUC gefordert.
4. Eine Woche nach der Operation entfernen Sie die Nähte oder Klammern.

10. Follow-up-Verfahren

HINWEIS: Um die Genauigkeit der Injektionstechnik zu bestimmen, injizieren Sie Trypanblau-Farbstoff wie oben beschrieben und euthanasieren Sie das Tier sofort (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) und führen Sie eine Laminektomie durch, um das Ergebnis zu visualisieren.

1. Während das Tier unter Narkose bleibt, euthanasieren Sie es, indem Sie eine tödliche Dosis Pentobarbital durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 150 mg/kg verabreichen.
2. Sobald die Atmung und die Herzaktivität aufhören, öffnen Sie die Brusthöhle, um den Tod zu gewährleisten. Verlängern Sie den chirurgischen Schnitt über den Rücken bis zum Nacken.
3. Machen Sie einen 4 cm langen Schnitt in den Muskel parallel zur Wirbelsäule auf beiden Seiten der Dornfortsätze und halten Sie sich dabei so nah wie möglich an den Fortsätzen.
4. Entfernen Sie mit einer feinen Zange oder Schere den Muskel zwischen den Dornfortsätzen.
5. Die Dornfortsätze von L6 bis zur unteren Brustwirbelsäule werden mit Hilfe eines Rongeurs entfernt (siehe Materialtabelle). Vermeiden Sie Drehbewegungen, da diese die Rongeure beschädigen können.
6. Führen Sie die untere Spitze des Rongeur unter die L5-Lamina ein und entfernen Sie den Knochen über dem Rückenmark, indem Sie mehrere "Bisse" aus ihm herausnehmen.
   HINWEIS: Das Zurückziehen des L6-Dornfortsatzes kann das Einführen der Spitze des Rongeurs erleichtern. Es muss darauf geachtet werden, dass das Rückenmark nicht geschädigt wird.
7. Erweitern Sie die Laminektomie mindestens vier Laminae rostral. Untersuchen Sie die Innenseite der Schichten auf Anzeichen von Farbstoffen, die auf eine fehlgeschlagene Injektion hinweisen können.

Ergebnisse

Um die Genauigkeit der Injektionstechnik zu bestimmen, wurde ein Farbstoff, Trypanblau, als Surrogat für das Therapeutikum verwendet. Dieser Farbstoff bindet leicht an Proteine, so dass er in der Regel in der Struktur bleibt, in die er injiziert wurde. Dies bedeutet, dass der Farbstoff die Verteilung des Therapeutikums nach der Injektion möglicherweise nicht genau vorhersagt. Es wird einfach verwendet, um die Genauigkeit der Injektion anzuzeigen. Bei erfolgreicher Einführung in den Lumbalspülkasten bindet Trypanblau ...

Diskussion

Das ZNS ist von den unterschiedlichsten Erkrankungen betroffen. Die Bereitstellung einer funktionellen Kopie des relevanten Gens über einen viralen Vektor ist eine attraktive Behandlungsstrategie für solche, die rezessiv und monogen Natur sind, wie z. B. spinale Muskelatrophie. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schließt jedoch die meisten intravenös verabreichten Gentherapievektoren aus¹¹. Diejenigen, die die BHS überwinden können, wie z. B. AAV9, müssen in hohen Dosen verabreicht werden, um den...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection