使用外排缺陷细菌菌株和单拷贝基因表达系统表征 鲍曼不动杆 菌的多药外排系统

摘要

我们描述了一种简单的程序，使用基于 mini-Tn7 的表达系统将外排泵基因进行单拷贝染色体互补，并将其转化为鲍 曼不动杆菌的工程外排缺陷菌株。这种精确的遗传工具允许受控的基因表达，这是表征多重耐药病原体中外排泵的关键。

摘要

鲍曼不动杆 菌因其对抗生素的广泛耐药性而被公认为一种具有挑战性的革兰氏阴性病原体。了解这种耐药性背后的机制对于设计新的有效治疗方案至关重要。不幸的是，由于缺乏合适的基因操作工具，我们在 鲍曼不动 杆菌中研究这些机制的能力受到阻碍。在这里，我们描述了利用基于染色体 mini-Tn7 的系统在缺乏功能性 RND 型外排机制的 鲍曼不动杆 菌菌株中实现单拷贝基因表达的方法。单拷贝插入和诱导型外排泵表达非常有利，因为细菌细胞通常对高拷贝数质粒上存在 RND 外排操纵子的耐受性较差。此外，将重组 mini-Tn7 表达载体掺入替代鲍 曼不动 杆菌宿主的染色体中，具有更高的外排灵敏度，有助于规避来自其他外排泵的干扰。该系统不仅对于研究未表征的细菌外排泵很有价值，而且对于评估靶向这些泵的潜在抑制剂的有效性也很有价值。

引言

鲍曼不动杆 菌是世界卫生组织的头等大事原体，因为它对所有类别的抗生素都具有耐药性¹。它是一种机会性病原体，主要影响住院、受伤或免疫功能低下的人。 鲍曼不动杆 菌主要 通过 外排泵逃避抗生素，最相关的是抗结瘤分裂 （RND） 出口商^{家族 2}。了解这些外排泵的机械工作原理将使人们能够开发有针对性的治疗方案。

可以特异性区分细胞过程的一种常见方法是通过基因操作。然而，可用于鲍曼不动杆菌遗传研究的工具有限，并且进一步混淆了实验设计，临床分离株通常对遗传操作中常规用于选择的抗生素具有耐药性³。在专门研究外排泵时遇到的第二个障碍是，它们受到严格监管（通常受到未知因素的影响），因此很难准确地将功能隔离并归因于单个泵⁴。鉴于需要扩展研究工具箱，我们开发了一种基于 Mini-Tn7 的单拷贝插入诱导型表达系统，该系统包含 Flp 重组酶靶标 （FRT） 盒，允许去除选择标记 ^5,6,7（图 1

研究方案

1.实验准备

1. 用目的基因纯化质粒pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ （插入质粒， 图2A）。
   注意：在这里，感兴趣的基因是 adeIJK。最终质粒浓度应为 ≥100 ng/μL。
2. 纯化辅助质粒（pTNS2）⁹和切除质粒（pFLP2^ab）⁶（分别为图2B，C），理想情况下最终质粒DNA浓度为≥100ng/μL。
3. 准备 50 mL 无菌超纯水和 25 mL 无菌 LB （Lennox） 肉汤（参见 材料表）。
4. 制备至少 10 LB 琼脂平板，每个平板含有以下添加剂：普通（无添加剂）、50 μg/mL 的庆大霉素 （Gm）、200 μg/mL 的羧苄青霉素 （Cb）（ 通过 氨苄青霉素耐药基因进行选择）和 5% 蔗糖（参见 材料表）。
5. 划出用于插入LB琼脂的菌株，并在37°C下孵育16-18小时。
   注意：该协议必须尽可能在无菌环境中通过使用工作....

讨论

尽管在 鲍曼不动杆 菌中插入可诱导的单拷贝基因表达系统的染色体插入过程在技术上很简单且不费力，但有几个重要步骤需要强调。首先，感受态细胞的制备需要尽可能在冰上进行，因为在用冰冷水替换培养基的过程中细胞会变得脆弱。理想情况下，离心步骤在4°C下进行，但在室温下离心是可以接受的。鉴于水洗过程中细胞的脆弱性越来越强，轻柔的移液也很重要。其次，电穿孔对离子?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates