使用外排缺陷细菌菌株和单拷贝基因表达系统表征 鲍曼不动杆 菌的多药外排系统

摘要

我们描述了一种简单的程序，使用基于 mini-Tn7 的表达系统将外排泵基因进行单拷贝染色体互补，并将其转化为鲍 曼不动杆菌的工程外排缺陷菌株。这种精确的遗传工具允许受控的基因表达，这是表征多重耐药病原体中外排泵的关键。

摘要

鲍曼不动杆 菌因其对抗生素的广泛耐药性而被公认为一种具有挑战性的革兰氏阴性病原体。了解这种耐药性背后的机制对于设计新的有效治疗方案至关重要。不幸的是，由于缺乏合适的基因操作工具，我们在 鲍曼不动 杆菌中研究这些机制的能力受到阻碍。在这里，我们描述了利用基于染色体 mini-Tn7 的系统在缺乏功能性 RND 型外排机制的 鲍曼不动杆 菌菌株中实现单拷贝基因表达的方法。单拷贝插入和诱导型外排泵表达非常有利，因为细菌细胞通常对高拷贝数质粒上存在 RND 外排操纵子的耐受性较差。此外，将重组 mini-Tn7 表达载体掺入替代鲍 曼不动 杆菌宿主的染色体中，具有更高的外排灵敏度，有助于规避来自其他外排泵的干扰。该系统不仅对于研究未表征的细菌外排泵很有价值，而且对于评估靶向这些泵的潜在抑制剂的有效性也很有价值。

引言

鲍曼不动杆 菌是世界卫生组织的头等大事原体，因为它对所有类别的抗生素都具有耐药性¹。它是一种机会性病原体，主要影响住院、受伤或免疫功能低下的人。 鲍曼不动杆 菌主要 通过 外排泵逃避抗生素，最相关的是抗结瘤分裂 （RND） 出口商^{家族 2}。了解这些外排泵的机械工作原理将使人们能够开发有针对性的治疗方案。

可以特异性区分细胞过程的一种常见方法是通过基因操作。然而，可用于鲍曼不动杆菌遗传研究的工具有限，并且进一步混淆了实验设计，临床分离株通常对遗传操作中常规用于选择的抗生素具有耐药性³。在专门研究外排泵时遇到的第二个障碍是，它们受到严格监管（通常受到未知因素的影响），因此很难准确地将功能隔离并归因于单个泵⁴。鉴于需要扩展研究工具箱，我们开发了一种基于 Mini-Tn7 的单拷贝插入诱导型表达系统，该系统包含 Flp 重组酶靶标 （FRT） 盒，允许去除选择标记 ^5,6,7（图 1）。这种优雅的克隆和表达系统最初是为假单胞菌 ^8,9,10 创建的，用于将单拷贝外排泵补体生成到我们生成的鲍曼不动杆菌 （ATCC 17978::ΔadeIJK，Δ adeFGH，Δ adeAB:以下简称鲍曼不动杆菌 AB258） 的 RND 外排泵缺陷菌株中¹¹.能够一次研究一个外排泵，并且不会以高拷贝表达淹没细菌细胞（如通常在基于质粒的表达系统中看到的那样），人们可以更好地了解每个外排泵的关键生理方面，同时将干扰降至最低，并减少并发症。

本文介绍了如何使用 mini-Tn7 系统通过在 9 天内执行的一系列简单步骤，将缺失的目的基因 RND 外排泵 adeIJK 补合成鲍曼不动杆菌 AB258 的染色体⁷。第一组步骤在保守的 glmS 基因下游的单个 attTn7 插入位点（图 3A）重新引入克隆到基于 mini-Tn7 的插入质粒（图 2A）中的缺失的外排泵基因。该过程由编码 Tn7 驱动插入所需的转座酶基因的非复制辅助质粒 （图 2B） 促进。第二组步骤使用切除质粒（图2C）进行Flp重组酶介导的庆大霉素基因的去除，两侧是FRT位点（图3B），以产生未标记的菌株。虽然该系统用于阐明RND外排泵在抗生素耐药性方面的基本作用和可能的抑制剂，但它可用于研究任何感兴趣的基因。

研究方案

1.实验准备

1. 用目的基因纯化质粒pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ （插入质粒， 图2A）。
   注意:在这里，感兴趣的基因是 adeIJK。最终质粒浓度应为 ≥100 ng/μL。
2. 纯化辅助质粒（pTNS2）⁹和切除质粒（pFLP2^ab）⁶（分别为图2B，C），理想情况下最终质粒DNA浓度为≥100ng/μL。
3. 准备 50 mL 无菌超纯水和 25 mL 无菌 LB （Lennox） 肉汤（参见 材料表）。
4. 制备至少 10 LB 琼脂平板，每个平板含有以下添加剂:普通（无添加剂）、50 μg/mL 的庆大霉素 （Gm）、200 μg/mL 的羧苄青霉素 （Cb）（ 通过 氨苄青霉素耐药基因进行选择）和 5% 蔗糖（参见 材料表）。
5. 划出用于插入LB琼脂的菌株，并在37°C下孵育16-18小时。
   注意:该协议必须尽可能在无菌环境中通过使用工作台上的本生燃烧器或生物安全柜进行。所有耗材（移液器吸头、接种环、微量离心管等）都必须是无菌的。

2. 培养准备

1. 使用无菌接种环或无菌木制接种棒，将 鲍曼不动 杆菌 AB258 的单个菌落接种到无菌 13 mL 培养管中的 4 mL LB 肉汤中。
   注意:单个 4 mL 培养物用于一个样品和一个对照。根据所需的样品数量增加培养物的数量。
2. 在37°C振荡（250rpm）下孵育过夜。
3. 将一瓶无菌蒸馏水（25-50mL）置于4°C过夜，用于步骤3。

3. 电感受态电池的制备

1. 将所有无菌 1.5 mL 微量离心管（每次培养两个）和无菌电穿孔比色皿（每个培养物两个）放在冰上（参见 材料表）。在整个过程中，尽可能多地将样品放在冰上。
2. 将储存在4°C的无菌水瓶放在冰上。
3. 将 1.5 mL 过夜细菌培养物转移到其中一个 1.5 mL 微量离心管中。
4. 以13,000× g 离心2分钟以沉淀细胞。
   注意:理想情况下，离心应在4°C下进行，但环境温度离心是可以接受的，并且不会有害。
5. 使用 1 mL 移液管，在不干扰细胞沉淀的情况下除去所有上清液。
6. 将另外 1.5 mL 细菌培养物加入同一微量离心管中。以13,000× g 离心2分钟，然后除去所有上清液。
7. 用剩余的 1 mL 培养物最后一次重复步骤 3.6。
8. 向细胞沉淀中加入 1 mL 冰冷无菌水，并用轻柔的移液液管重悬，直到沉淀不再位于微量离心管的底部。
9. 将重悬细胞以13,000× g 离心2分钟。
10. 使用 1 mL 移液管小心地除去上清液。不要倒掉上清液，特别是在随后的洗涤步骤中，当细胞倾向于形成不太紧凑的沉淀时。
11. 用冰冷的无菌水重复此洗涤步骤，步骤3.8至步骤3.10，再重复两次。
12. 将最终细胞沉淀轻轻重悬于200μL冰冷无菌水中。
13. 将 100 μL 最终细胞悬液转移到第二个冰冷的 1.5 mL 微量离心管中。第二个等分试样将成为电穿孔的阴性对照。将细胞样品放在冰上。

4. 电穿孔

1. 预热每个样品的1mLLB肉汤和一个LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板（在步骤1.4中制备），并在设置为37°C的静态培养箱中对照。
2. 在 5 μL 或更小的总体积中，将 100-200 ng pTNS2 辅助质粒和 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK 插入质粒加入等分试样的电感受态细胞中。
3. 用指尖轻敲击混合，以确保质粒与电感受态细胞完全混合，而不会引入气泡。
4. 将等量的无菌蒸馏水加入阴性对照细胞等分试样中，并如上所述轻轻混合。
5. 将样品在冰上孵育20分钟。
6. 将整个细胞样品转移到冰冷的电穿孔比色皿中，然后将比色皿放回冰上。对阴性对照细胞样品重复上述步骤。
7. 电穿孔细胞样品。
   1. 打开电穿孔仪并将其设置为 2.0 kV （25 μF， 200 Ω）（参见 材料表）。
   2. 用软纸擦拭比色皿表面，以去除任何粘附的冰或水分。
   3. 将比色皿插入电穿孔器并进行电击。
   4. 立即将 0.9 mL 预热的 LB 肉汤加入比色皿中的细胞中，并轻轻上下移液以将细胞与培养基混合。
   5. 将整个细胞悬液转移到新的 1.5 mL 微量离心管（室温）中。
   6. 检查电穿孔仪上的时间常数值;为获得最佳结果，此值应介于 4 和 6 之间。
8. 对阴性对照细胞样品重复电穿孔程序（步骤4.7.1至步骤4.7.6）。
9. 将电穿孔样品在37°C下以250rpm孵育1小时，以允许细胞回收。
10. 使用接种撒布器，将每个电穿孔细胞样品的100μL铺在预热的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
    1. 将剩余样品以13,000× g 离心2分钟以沉淀细胞。
    2. 使用移液管除去所有上清液后，将细胞重悬于100μLLB肉汤中。
    3. 将每个样品铺在单个预热的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
       注意:电穿孔效率可能取决于应变。首次对菌株进行电穿孔时，可以板出不同体积的电穿孔样品，甚至稀释度，以确保所得板具有分离的菌落。
11. 将板在37°C孵育16-18小时。

5. 选择转化菌落进行基于PCR的筛选

1. 检查电穿孔板。阴性对照不应有菌落;样品应具有不同的菌落。
   注意:在这一步以及产生带有菌落或贴片的琼脂平板的所有后续步骤中，具有菌落的平板可以在4°C下储存长达3天，然后再继续。
2. 使用无菌牙签，从LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板中取出多达10个单菌落，并将它们贴在新鲜的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
3. 将板在37°C孵育16-18小时。

6. 通过菌落PCR验证染色体插入

1. 从培养箱中取出含有贴片菌落的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板。
2. 使用无菌牙签或无菌移液管吸头，将贴片中的一小部分（约一个大菌落大小）从贴片中取出到0.2 mL PCR管中的20 μL无菌蒸馏水中;搅拌均匀。当细胞从牙签中释放出来时，水样应该变得明显浑浊。准备任意数量的需要筛选的样品，但 6 个就足够了。
3. 将含有细菌悬浮液的PCR管在100°C下孵育5-10分钟。
4. 使用微型离心机（参见 材料表），以固定的最大速度旋转样品2分钟以沉淀细胞碎片。
5. 将上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中，并将其置于冰上。该样品包含用于PCR反应的模板DNA。
   注意:在进行PCR之前，该模板DNA可以储存在-20°C。
6. 制备含有 1x 聚合酶缓冲液、200 μM dNTP、0.18 μM ABglmS2_F_New正向引物、0.18 μM Tn7R 反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶和 1 μL 制备的模板 DNA 的 PCR 反应混合物，总体积为 25 μL。 制备无模板对照（NTC），包括除模板DNA以外的所有DNA（参见 材料表）。
7. 将反应条件输入热循环仪:95°C2分钟;95°C30秒，49°C30秒，72°C30秒，共35个循环;72°C10分钟;12°C保持。运行示例。
8. 将DNA上样染料加入至终浓度为1x后，将10μL每个PCR反应上样于2%琼脂糖凝胶上，并在80V下运行40分钟。该引物对的预期扩增子大小为 382 bp。NTC 不应有条带。
9. 确定产生预期PCR产物的样品。从任何PCR阳性贴片在LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上制备条纹板;在37°C孵育16-18小时。目标是生成具有单个菌落的板，用于制备甘油储备液以保存该标记菌株，并作为创建未标记菌株的起点（如下所述）。

7. 使用 pFLP2^ab 去除 Gm R 标记物

1. 按照步骤 2:培养物制备中提到的步骤进行操作。用于制备过夜培养物的样品是来自LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板的单个菌落，在步骤6.9中制备以产生离散菌落。
2. 按照步骤3中提到的步骤:电感受态电池的制备。从过夜培养物中制备细胞进行电穿孔。
3. 按照步骤4:电穿孔中提到的步骤进行操作。在这里，引入细胞的质粒是pFLP2^ab （100-200ng），它将去除庆大霉素抗性基因，位于染色体插入的感兴趣基因的侧翼。
4. 细胞恢复1小时（步骤4.9）后，将100μL电穿孔细胞样品铺在预热的LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板上（在步骤1.4中制备）。这种选择性压力确保只有携带 pFLP2^ab 切除质粒的细胞才能生长。
5. 将板在37°C孵育16-18小时。
6. 检查平板是否有菌落。阴性对照板不应有菌落;LB + Cb²⁰⁰ 琼脂样品板应具有不同的菌落。
7. 使用无菌牙签，将多达 20 个分离的菌落交叉贴在 LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板和 LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
8. 将板在37°C下孵育16-18小时。
9. 检查板是否有补丁。在 LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板上生长但不在 LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上生长的克隆已从原始插入片段中去除庆大霉素抗性基因。
10. 选择对羧苄苄青霉素耐药且庆大霉素易在补充有 5% （w/v） 蔗糖的单个 LB 琼脂平板上划线的贴片，这迫使 pFLP2^ab 质粒从细菌中排出。最多选择 10 个菌落。
11. 将板在37°C下孵育16-18小时。
12. 检查平板是否有菌落。
13. 作为pFLP2^ab 质粒丢失的最终确认，将5%蔗糖平板中的4-6个分离菌落交叉贴片到LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板和LB琼脂平板上。
14. 将板在37°C下孵育16-18小时。
15. 选择在LB琼脂平板上生长的克隆，该克隆对制备甘油原液对羧苄青霉素敏感，以保存这种未标记的菌株。
    1. 使用靶向庆大霉素抗性基因的引物，可以通过集落PCR（步骤6:通过集落PCR验证染色体插入）对未标记菌株进行基因验证。
    2. 制备含有 1x 聚合酶缓冲液、200 μM dNTP、0.18 μM Gm_F正向引物、0.18 μM Gm_R反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶和 1 μL 制备的模板 DNA 的 PCR 反应混合物，总体积为 25 μL。 制备一个无模板对照（NTC），包括除模板DNA以外的所有模板， 以及使用来自标记菌株的 DNA 的阳性对照。
    3. 将反应条件输入热循环仪:95°C2分钟;95°C30秒，50°C30秒，72°C40秒，共35次循环;72°C10分钟;12°C保持。运行示例。
    4. 在加入DNA上样染料至终浓度为1x后，将10μL每个PCR反应上样于1%琼脂糖凝胶上，并在80V下运行40分钟。该引物对的预期扩增子大小为 525 bp。阳性对照应具有单个条带;样品和NTC不应有条带。

结果

染色体插入过程在3天内总共只需要2小时，即可看到在选择性琼脂平板上生长的结果菌落（图1A-C）。转化板上的预期菌落数量取决于菌株:人们可能会看到 20-30 甚至数百个菌落，因为在 attTn7 位点插入 Tn7 是特异性和有效的⁹。将转化板菌落贴到选择性培养基上（图4A）可保留转化的菌株，并为菌落PCR筛选...

讨论

尽管在 鲍曼不动杆 菌中插入可诱导的单拷贝基因表达系统的染色体插入过程在技术上很简单且不费力，但有几个重要步骤需要强调。首先，感受态细胞的制备需要尽可能在冰上进行，因为在用冰冷水替换培养基的过程中细胞会变得脆弱。理想情况下，离心步骤在4°C下进行，但在室温下离心是可以接受的。鉴于水洗过程中细胞的脆弱性越来越强，轻柔的移液也很重要。其次，电穿孔对离子?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates