排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

要約

我々は、 アシネトバクター・バウマニの遺伝子操作された排出不全株に、mini-Tn7ベースの発現系を用いて、排出ポンプ遺伝子の単一コピー染色体相補のための簡単な手順について述べる。この精密な遺伝学的ツールにより、多剤耐性病原体における排出ポンプの特性評価の鍵となる遺伝子発現を制御することができます。

要約

アシネトバクター・バウマニは 、抗生物質に対する耐性が広範囲に及ぶため、困難なグラム陰性病原体として認識されています。この耐性の背後にあるメカニズムを理解することは、新しく効果的な治療法の選択肢を設計するために重要です。残念なことに、 A. baumannii のこれらのメカニズムを調査する私たちの能力は、適切な遺伝子操作ツールの不足によって妨げられています。本稿では、染色体mini-Tn7系を利用して、機能的なRND型排出機構を欠く A. baumannii 株の単一コピー遺伝子発現を実現する方法について述べる。高コピー数プラスミド上のRND排出オペロンの存在は、細菌細胞による忍容性が低いことが多いため、単一コピー挿入および誘導性排出ポンプ発現は非常に有利です。さらに、排出感受性を高めた組換えmini-Tn7発現ベクターを代理宿主A . baumannii の染色体に組み込むことで、他の排出ポンプからの干渉を回避することができます。このシステムは、特性不明の細菌排出ポンプの調査だけでなく、これらのポンプを標的とする潜在的な阻害剤の有効性を評価するためにも有用です。

概要

アシネトバクター・バウマニは 、すべてのクラスの抗生物質に対する包括的な耐性により、世界保健機関(WHO)の最優先病原体^です1。これは、主に入院、負傷、または免疫不全の人々に影響を及ぼす日和見病原体です。 A. baumannii は、排出ポンプ を介して 抗生物質を主に回避しており、最も関連性が高いのは、耐性結節部(RND)ファミリーの輸出業者^です2。これらの排出ポンプが機構的にどのように機能するかを理解することで、標的を絞った治療オプションを開発することができます。

細胞プロセスを特異的に区別できる一般的な方法の1つは、遺伝子操作によるものです。しかし、A. baumanniiの遺伝子研究に利用できるツールは限られており、実験デザインをさらに混乱させるために、臨床分離株は、遺伝子操作の選択に日常的に使用される抗生物質に耐性を持つことがよくあります³。排出ポンプを具体的に研究する際に遭遇する2つ目のハードルは、排出ポンプが厳密に規制されており、多くの場合、未知の要因によって規制されているため、機能を正確に分離して^{単一のポンプに}帰属させることが困難であることです4。研究ツールボックスを拡張する必要性を認識し、選択

プロトコル

1. 実験準備

1. プラスミドpUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (挿入プラスミド、 図2A)を目的の遺伝子で精製します。
   注:ここで、目的の遺伝子は adeIJKです。最終的なプラスミド濃度は ≥100 ng/μL です。
2. ヘルパープラスミド(pTNS2)⁹ および切除プラスミド(pFLP2^ab)⁶ (それぞれ図 2B、C)を、理想的には最終プラスミド DNA 濃度 ≥100 ng/μL になるまで精製します。
3. 50 mLの滅菌超純水と25 mLの滅菌LB(Lennox)ブロスを調製します( 材料表を参照)。
4. プレーン(添加物なし)、ゲンタマイシン(Gm)(50 μg/mL)、カルベニシリン(Cb)(200 μg/mL)(アンピシリン耐性遺伝子 による 選択用)、および5%スクロース( 材料表を参照)を添加した、最低10 LB寒天プレートを調製します。
5. LB寒天への....

ディスカッション

A. baumanniiにおける誘導性単一コピー遺伝子発現系の染色体挿入のこの手順は、技術的には簡単で労働集約的ではありませんが、強調する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、培地を氷冷水で置き換える際に細胞が壊れやすくなるため、コンピテントセルの調製は可能な限り氷上で行う必要があります。遠心分離ステップは4°Cで行うのが理想的ですが、室温での遠心.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates