排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

要約

我々は、 アシネトバクター・バウマニの遺伝子操作された排出不全株に、mini-Tn7ベースの発現系を用いて、排出ポンプ遺伝子の単一コピー染色体相補のための簡単な手順について述べる。この精密な遺伝学的ツールにより、多剤耐性病原体における排出ポンプの特性評価の鍵となる遺伝子発現を制御することができます。

要約

アシネトバクター・バウマニは 、抗生物質に対する耐性が広範囲に及ぶため、困難なグラム陰性病原体として認識されています。この耐性の背後にあるメカニズムを理解することは、新しく効果的な治療法の選択肢を設計するために重要です。残念なことに、 A. baumannii のこれらのメカニズムを調査する私たちの能力は、適切な遺伝子操作ツールの不足によって妨げられています。本稿では、染色体mini-Tn7系を利用して、機能的なRND型排出機構を欠く A. baumannii 株の単一コピー遺伝子発現を実現する方法について述べる。高コピー数プラスミド上のRND排出オペロンの存在は、細菌細胞による忍容性が低いことが多いため、単一コピー挿入および誘導性排出ポンプ発現は非常に有利です。さらに、排出感受性を高めた組換えmini-Tn7発現ベクターを代理宿主A . baumannii の染色体に組み込むことで、他の排出ポンプからの干渉を回避することができます。このシステムは、特性不明の細菌排出ポンプの調査だけでなく、これらのポンプを標的とする潜在的な阻害剤の有効性を評価するためにも有用です。

概要

アシネトバクター・バウマニは 、すべてのクラスの抗生物質に対する包括的な耐性により、世界保健機関(WHO)の最優先病原体^です1。これは、主に入院、負傷、または免疫不全の人々に影響を及ぼす日和見病原体です。 A. baumannii は、排出ポンプ を介して 抗生物質を主に回避しており、最も関連性が高いのは、耐性結節部(RND)ファミリーの輸出業者^です2。これらの排出ポンプが機構的にどのように機能するかを理解することで、標的を絞った治療オプションを開発することができます。

細胞プロセスを特異的に区別できる一般的な方法の1つは、遺伝子操作によるものです。しかし、A. baumanniiの遺伝子研究に利用できるツールは限られており、実験デザインをさらに混乱させるために、臨床分離株は、遺伝子操作の選択に日常的に使用される抗生物質に耐性を持つことがよくあります³。排出ポンプを具体的に研究する際に遭遇する2つ目のハードルは、排出ポンプが厳密に規制されており、多くの場合、未知の要因によって規制されているため、機能を正確に分離して^{単一のポンプに}帰属させることが困難であることです4。研究ツールボックスを拡張する必要性を認識し、選択^{マーカー5,6,7}の除去を可能にするFlpリコンビナーゼターゲット(FRT)カセットを組み込んだ、ミニTn7ベースの単一コピー挿入誘導性発現システムを開発しました(図1)。シュードモナス^8,9,10のために最初に作成されたこのエレガントなクローニングおよび発現システムを使用して、A. baumanniiのRND排出ポンプ欠損株(ATCC 17978::ΔadeIJK、Δ adeFGH、ΔadeAB:以下、A. baumannii AB258と呼ぶ)にシングルコピー排出ポンプ補体を生成し、¹¹.一度に1つの排出ポンプを研究し、(プラスミドベースの発現システムで一般的に見られるように)高コピー発現で細菌細胞を圧倒しないため、干渉を最小限に抑え、合併症を減らしながら、各排出ポンプの重要な生理学的側面についてよりよく学ぶことができます。

本稿では、mini-Tn7システムを使用して、^{9日間にわたって}実行される一連の単純なステップを通じて、A. baumannii AB258の染色体に目的の欠失遺伝子であるRND排出ポンプadeIJKを補完する方法について説明します7。最初の一連のステップでは、十分に保存されたglmS遺伝子(図3A)の下流の単一のattTn7挿入部位に、mini-Tn7ベースの挿入プラスミド(図2A)にクローニングされた欠失排出ポンプ遺伝子を再導入します。このプロセスは、Tn7駆動の挿入に必要なトランスポザーゼ遺伝子をコードする非複製性ヘルパープラスミド(図2B)によって促進されます。第2のステップでは、切除プラスミド(図2C)を使用して、FRT部位(図3B)に隣接するゲンタマイシン遺伝子をFlpリコンビナーゼ媒介で除去し、マークのない株を作製します。このシステムは、抗生物質耐性に関するRND排出ポンプの本質的な役割と可能な阻害剤を解明するために使用されますが、目的の遺伝子を調べるために使用できます。

プロトコル

1. 実験準備

1. プラスミドpUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (挿入プラスミド、 図2A)を目的の遺伝子で精製します。
   注:ここで、目的の遺伝子は adeIJKです。最終的なプラスミド濃度は ≥100 ng/μL です。
2. ヘルパープラスミド(pTNS2)⁹ および切除プラスミド(pFLP2^ab)⁶ (それぞれ図 2B、C)を、理想的には最終プラスミド DNA 濃度 ≥100 ng/μL になるまで精製します。
3. 50 mLの滅菌超純水と25 mLの滅菌LB(Lennox)ブロスを調製します( 材料表を参照)。
4. プレーン(添加物なし)、ゲンタマイシン(Gm)(50 μg/mL)、カルベニシリン(Cb)(200 μg/mL)(アンピシリン耐性遺伝子 による 選択用)、および5%スクロース( 材料表を参照)を添加した、最低10 LB寒天プレートを調製します。
5. LB寒天への挿入に使用する菌株をストリークし、37°Cで16〜18時間インキュベートします。 ここでは、 A. baumannii AB258を使用します。
   注:このプロトコルは、ベンチまたは生物学的安全キャビネットでブンゼンバーナーを使用して、可能な限り無菌環境で実行する必要があります。すべての消耗品(ピペットチップ、接種ループ、マイクロチューブなど)は滅菌済みである必要があります。

2. 培養の準備

1. A. baumannii AB258 の単一コロニーを、滅菌済み 13 mL 培養チューブ内の 4 mL の LB ブロスに、滅菌済み接種ループまたは滅菌済みの木製接種スティックを使用して接種します。
   注:1 つのサンプルと 1 つのコントロールに 1 つの 4 mL 培養物を使用します。必要なサンプル数に応じて培養数を増やします。
2. 37°Cで振とう(250rpm)しながら一晩インキュベートします。
3. 滅菌蒸留水(25〜50 mL)のボトルを4°Cで一晩置き、ステップ3で使用します。

3. エレクトロコンピテントセルの作製

1. すべての滅菌済み 1.5 mL マイクロチューブ(培養ごとに 2 本)および滅菌済みエレクトロポレーションキュベット(培養ごとに 2 本)を氷上に置きます( 材料表を参照)。手順全体を通して、サンプルを可能な限り氷上に保管してください。
2. 4°Cで保存した滅菌水のボトルを氷の上に置きます。
3. 1.5 mLの一晩培養した細菌を1.5 mLのマイクロチューブの1つに移します。
4. 13,000 x g で2分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   注:遠心分離は4°Cで行うのが理想的ですが、常温での遠心分離は許容範囲であり、有害ではありません。
5. 1 mLのピペットを使用して、細胞ペレットを乱すことなく上清をすべて除去します。
6. さらに1.5 mLの細菌培養液を同じマイクロチューブに加えます。13,000 x g で2分間遠心分離し、上清をすべて除去します。
7. 残りの1 mLの培養液で、最後にステップ3.6をもう1回繰り返します。
8. 細胞ペレットに氷冷滅菌水1 mLを加え、ペレットがマイクロチューブの底に留まらなくなるまで、穏やかなピペッティングで再懸濁します。
9. 再懸濁した細胞を13,000 x g で2分間遠心分離します。
10. 1 mLのピペットを使用して上清を慎重に除去します。上清は、特に細胞があまりコンパクトでないペレットを形成する傾向があるその後の洗浄ステップでは、注がないでください。
11. この洗浄ステップを氷冷滅菌水で、ステップ3.8からステップ3.10までさらに2回繰り返します。
12. 最終細胞ペレットを200 μLの氷冷滅菌水に静かに再懸濁します。
13. 最終細胞懸濁液100 μLを2本目の氷冷1.5 mLマイクロチューブに移します。この 2 番目のアリコートは、エレクトロポレーションのネガティブコントロールになります。細胞サンプルを氷上に保管してください。

4. エレクトロポレーション

1. 各サンプルについて、1 mLのLBブロスと1枚のLB + Gm⁵⁰ 寒天プレート(ステップ1.4で調製)を予熱し、37°Cに設定した静的インキュベーターでコントロールします。
2. 合計容量が5 μL以下で、pTNS2ヘルパープラスミドとpUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK挿入プラスミドをそれぞれ100〜200 ngのエレクトロコンピテントセルのアリコートに添加します。
3. 指先で軽く叩いて混合し、気泡を発生させることなくプラスミドとエレクトロコンピテントセルを完全に混合します。
4. 等量の滅菌蒸留水をネガティブコントロールセルのアリコートに加え、上記のように穏やかに混合します。
5. サンプルを氷上で20分間インキュベートします。
6. 細胞サンプル全体を氷冷エレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットを氷上に戻します。ネガティブコントロール細胞サンプルについて繰り返します。
7. 細胞サンプルをエレクトロポレーションします。
   1. エレクトロポレーターの電源を入れ、2.0 kV(25 μF、200 Ω)に設定します( 材料表を参照)。
   2. キュベットの表面を柔らかいティッシュで拭いて、付着した氷や湿気を取り除きます。
   3. キュベットをエレクトロポレーターに挿入し、電気ショックを与えます。
   4. ただちに0.9 mLの予熱したLBブロスをキュベット内の細胞に加え、静かに上下にピペットで移り、細胞を培地と混合します。
   5. 細胞懸濁液全体を新しい1.5 mLのマイクロチューブ(室温)に移します。
   6. エレクトロポレーターの時定数値を確認してください。最良の結果を得るには、この値を 4 から 6 の間に設定する必要があります。
8. ネガティブコントロール細胞サンプルについて、エレクトロポレーション手順(ステップ4.7.1〜ステップ4.7.6)を繰り返します。
9. エレクトロポレーションしたサンプルを37°C、250rpmで1時間インキュベートし、細胞を回収します。
10. 接種スプレッダーを使用して、エレクトロポレーションした各細胞サンプル100 μLを、予め加温したLB +^{Gm 50} 寒天プレートに広げます。
    1. 残りのサンプルを13,000 x g で2分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    2. ピペットを使用して上清をすべて除去した後、細胞を100μLのLBブロスに再懸濁します。
    3. 各サンプル全体を、予熱した個々のLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートに広げます。
       注:エレクトロポレーション効率はひずみに依存する場合があります。初めて菌株をエレクトロポレーションする場合、エレクトロポレーションサンプルの異なる容量または希釈液をプレーティングして、得られたプレートに単離されたコロニーがあることを確認することは有益です。
11. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。

5. PCRベースのスクリーニングのための形質転換コロニーの選択

1. エレクトロポレーションプレートを確認してください。ネガティブコントロールにはコロニーがあってはなりません。サンプルには明確なコロニーが必要です。
   注:コロニーのあるプレートは、このステップおよびコロニーまたはパッチを含む寒天プレートが製造される後続のすべてのステップで、4°Cで最大3日間保存してから続行できます。
2. 滅菌爪楊枝を使用して、LB + Gm⁵⁰ 寒天プレートから最大10個の単一コロニーをピックアップし、それらを新しいLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートにパッチします。
3. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。

6. コロニーPCRによる染色体挿入の確認

1. パッチを当てたコロニーを含むLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートをインキュベーターから取り出します。
2. 滅菌済みつまようじまたは滅菌ピペットチップを使用して、パッチから少量(大きなコロニーのサイズ程度)を取り出し、0.2 mL PCRチューブ内の滅菌蒸留水20 μLに入れます。よく混ぜます。水サンプルは、細胞がつまようじから放出されると、目に見えて濁るはずです。スクリーニングが必要なサンプルはいくつでも準備できますが、6つで十分です。
3. 細菌懸濁液を含むPCRチューブを100°Cで5〜10分間インキュベートします。
4. ミニ遠心分離機( 材料表を参照)を使用して、サンプルを固定の最高速度で2分間回転させ、細胞破片をペレット化します。
5. 上清を新しい0.2 mLのPCRチューブに移し、氷上に置いてください。このサンプルには、PCR反応用のテンプレートDNAが含まれています。
   注:このテンプレートDNAは、PCRを進める前に-20°Cで保存できます。
6. 1x ポリメラーゼバッファー、200 μM dNTP、0.18 μM ABglmS2_F_New フォワードプライマー、0.18 μM Tn7R リバースプライマー(表1)、1 U の Taq DNA ポリメラーゼ、および調製したテンプレート DNA 1 μL を総容量 25 μL で調製した PCR 反応混合物を調製します。 テンプレートDNA以外のすべてを含む非テンプレートコントロール(NTC)を調製します( 材料表を参照)。
7. 反応条件をサーマルサイクラーに入力します:95°Cで2分間。95°Cで30秒、49°Cで30秒、72°Cで30秒、合計35サイクル。72°Cで10分間;12°C保持。サンプルを実行します。
8. 最終濃度が1倍になるようにDNAローディング色素を添加した後、各PCR反応液10 μLを2%アガロースゲルにロードし、80 Vで40分間泳動します。このプライマーペアの予想されるアンプリコンサイズは 382 bp です。NTCにはバンドがあってはなりません。
9. 期待されるPCR産物を産生したサンプルを特定します。PCR陽性パッチのいずれかからLB + Gm⁵⁰ 寒天プレート上にストリークプレートを調製します。37°Cで16〜18時間インキュベートします。目標は、このマークされた菌株を保存するためのグリセロールストックの調製と、マークされていない菌株(以下で説明)を作成するための出発点として、単一のコロニーを有するプレートを生成することです。

7. pFLP2^abを用いたGm Rマーカーの除去

1. ステップ2:培養の準備に記載されている手順に従ってください。一晩培養を調製するために使用したサンプルは、ステップ6.9で離散コロニーを生成するように調製したLB+^Gm50 寒天プレートからの単一コロニーである。
2. ステップ3:エレクトロコンピテントセルの準備に記載されている手順に従ってください。エレクトロポレーションのために一晩培養した細胞を調製します。
3. ステップ4:エレクトロポレーションに記載されている手順に従います。ここで、細胞に導入するプラスミドはpFLP2^ab (100-200 ng)であり、ゲンタマイシン耐性遺伝子を除去し、染色体に挿入された目的の遺伝子に隣接します。
4. 細胞が1時間回復した後(ステップ4.9)、エレクトロポレーションした細胞サンプル100 μLを予熱したLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレート(ステップ1.4で調製)に広げます。この選択圧により、pFLP2^ab 切除プラスミドを有する細胞のみが増殖します。
5. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
6. プレートにコロニーがないか確認してください。ネガティブコントロールプレートにはコロニーがあってはなりません。LB + Cb²⁰⁰ 寒天サンプルプレートには、明確なコロニーが必要です。
7. 滅菌爪楊枝を使用して、最大20個の単離されたコロニーをLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレートおよびLB + Gm⁵⁰ 寒天プレートにクロスパッチします。
8. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
9. プレートにパッチがないか確認します。LB + Cb²⁰⁰ 寒天プレート上では増殖するが、LB + Gm⁵⁰ 寒天プレートでは増殖しないクローンは、元のインサートからゲンタマイシン耐性遺伝子が除去されています。
10. カルベニシリン耐性でゲンタマイシンが感受性のあるパッチを選択し、5%(w/v)スクロースを添加して、pFLP2^ab プラスミドを細菌から強制的に排出する個々のLB寒天プレートにストリーキングします。最大10個のコロニーを選択します。
11. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
12. コロニーのプレートを確認します。
13. pFLP2^ab プラスミド損失の最終確認として、クロスパッチ4〜6個のコロニーを5%スクロースプレートからLB + Cb²⁰⁰ 寒天プレートおよびLB寒天プレートに単離しました。
14. プレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
15. LB寒天プレート上で増殖しており、このマークのない株を保存するためのグリセロールストックの調製にカルベニシリン感受性であるクローンを選択してください。
    1. マークされていない株の遺伝的検証は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を標的とするプライマーを使用して、コロニーPCR(ステップ6:コロニーPCRによる染色体挿入の確認)で行うことができます。
    2. 1x ポリメラーゼバッファー、200 μM dNTP、0.18 μM Gm_F フォワードプライマー、0.18 μM Gm_R リバースプライマー(表1)、1 U の Taq DNA ポリメラーゼ、および調製したテンプレート DNA 1 μL を総容量 25 μL で調製した PCR 反応混合物を調製します。 鋳型DNA以外のすべてを含む非鋳型コントロール(NTC)を調製し、 マークされた株からのDNAを使用したポジティブコントロール。
    3. 反応条件をサーマルサイクラーに入力します:95°Cで2分間。95°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで40秒、合計35サイクル。72°Cで10分間;12°C保持。サンプルを実行します。
    4. 最終濃度が1xになるようにDNAローディング色素を添加した後、各PCR反応液10 μLを1%アガロースゲルにロードし、80 Vで40分間泳動します。このプライマーペアの予想されるアンプリコンサイズは 525 bp です。ポジティブコントロールには 1 つのバンドが必要です。サンプルとNTCにはバンドがあってはなりません。

結果

染色体挿入手順は、選択的寒天プレート上で結果コロニーが成長するのを見るために、3日間で合計2時間しかかかりません(図1A-C)。形質転換プレート上のコロニーの予想数はひずみに依存します:attTn7部位へのTn7の挿入が特異^{的で効率的であるため}、20〜30個、さらには数百個のコロニーが見られる場合があります9。形質?...

ディスカッション

A. baumanniiにおける誘導性単一コピー遺伝子発現系の染色体挿入のこの手順は、技術的には簡単で労働集約的ではありませんが、強調する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、培地を氷冷水で置き換える際に細胞が壊れやすくなるため、コンピテントセルの調製は可能な限り氷上で行う必要があります。遠心分離ステップは4°Cで行うのが理想的ですが、室温での遠心...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates