유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

요약

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

초록

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 까다로운 그람 음성 병원체로 인식되고 있습니다. 새롭고 효과적인 치료 옵션을 설계하기 위해 이러한 내성 이면의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 불행히도, A. baumannii 에서 이러한 메커니즘을 조사할 수 있는 우리의 능력은 적절한 유전자 조작 도구의 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 여기서, 우리는 기능적 RND 유형 유출 메커니즘이 결여된 A. baumannii 균주에서 단일 복제 유전자 발현을 달성하기 위해 염색체 mini-Tn7 기반 시스템을 활용하는 방법을 설명합니다. single-copy insertion 및 inducible efflux pump 발현은 매우 유리한데, 이는 high-copy number plasmid에서 RND efflux operon의 존재가 종종 박테리아 세포에 의해 잘 견디지 못하기 때문입니다. 또한, 재조합 mini-Tn7 발현 벡터를 향상된 유출 민감도를 가진 대리 A. baumannii 숙주의 염색체에 통합하면 다른 유출 펌프의 간섭을 우회하는 데 도움이 됩니다. 이 시스템은 특성화되지 않은 박테리아 유출 펌프를 조사할 뿐만 아니라 이러한 펌프를 표적으로 하는 잠재적 억제제의 효과를 평가하는 데에도 유용합니다.

서문

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 모든 종류의 항생제에 대한 내성으로 인해 세계보건기구(WHO)의 최우선 순위 병원체입니다¹. 주로 입원, 부상 또는 면역력이 저하된 사람들에게 영향을 미치는 기회 병원체입니다. A. baumannii 는 유출 펌프 를 통해 항생제를 주로 회피하며, 가장 관련성이 높은 것은 RND(Resistance-Nodulation-Division) 수출업체^{제품군입니다 2}. 이러한 유출 펌프가 기계적으로 어떻게 작동하는지 이해하면 표적 치료 옵션을 개발할 수 있습니다.

세포 과정을 구체적으로 구별할 수 있는 한 가지 일반적인 방법은 유전자 조작을 통해서입니다. 그러나 A. baumannii 유전자 연구에 사용할 수 있는 도구는 제한적이며, 실험 설계를 더욱 혼란스럽게 하기 위해 임상 분리물은 종종 유전자 조작에서 선택에 일상적으로 사용되는 항생제에 내성이 있습니다³. 특히 유출 펌프를 연구할 때 직면하는 두 번째 장애물은 종종 알려지지 않은 요인에 의해 엄격하게 규제되어 단일 펌프로 기능을 정확하게....

프로토콜

1. 실험 준비

1. 플라스미드 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (삽입 플라스미드, 그림 2A)를 관심 유전자로 정제합니다.
   참고: 여기서 관심 유전자는 adeIJK입니다. 최종 플라스미드 농도는 ≥100ng/μL입니다.
2. helper plasmid (pTNS2)⁹ 및 excision plasmid (pFLP2^ab)⁶ (각각 그림 2B,C)를 최종 plasmid DNA 농도 ≥100 ng/μL로 정제합니다.
3. 멸균 초순수 50mL와 멸균 LB(Lennox) 육수 25mL를 준비합니다( 재료 표 참조).
4. 각각 플레인(첨가제 없음), 50μg/mL의 겐타마이신(Gm), 200μg/mL의 카르베니실린(Cb)(암피실린 내성 유전자를 통한 선택용) 및 5% 자당( 재료 표 참조)과 같은 첨가제가 포함된 최소 10LB 한....

토론

A. baumannii에서 유도 가능한 단일 복제 유전자 발현 시스템의 염색체 삽입을 위한 이 절차는 기술적으로 간단하고 노동 집약적이지 않지만 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 유능한 세포의 준비는 배지를 얼음처럼 차가운 물로 교체하는 동안 세포가 약해지기 때문에 가능한 한 얼음 위에서 수행되어야 합니다. 이상적으로는 원심분리 단계가 4°C에서 수행되지만 실온에서 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates