Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией

Резюме

Мы описываем простую процедуру однокопийной хромосомной комплементации гена насоса оттока с использованием системы экспрессии на основе mini-Tn7 в сконструированный штамм Acinetobacter baumannii с дефицитом эффлюкса. Этот точный генетический инструмент позволяет контролировать экспрессию генов, что является ключом к характеристике насосов оттока у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация

Acinetobacter baumannii признан опасным грамотрицательным патогеном из-за его широкой устойчивости к антибиотикам. Крайне важно понять механизмы, лежащие в основе этой резистентности, чтобы разработать новые и эффективные терапевтические варианты. К сожалению, наша способность исследовать эти механизмы у A. baumannii ограничена нехваткой подходящих инструментов для генетических манипуляций. В данной работе мы описываем методы использования хромосомной системы на основе мини-Tn7 для достижения однокопийной экспрессии гена у штамма A. baumannii , у которого отсутствуют функциональные механизмы оттока типа RND. Однокопийная вставка и индуцированная экспрессия насоса эффлюкса весьма выгодны, так как присутствие оперонов оттока RND на плазмидах с высоким числом копий часто плохо переносится бактериальными клетками. Кроме того, включение рекомбинантных векторов экспрессии мини-Tn7 в хромосому суррогатного хозяина A. baumannii с повышенной чувствительностью к эффлюксу помогает обойти помехи от других насосов оттока. Эта система полезна не только для исследования неохарактеризованных насосов бактериального оттока, но и для оценки эффективности потенциальных ингибиторов, нацеленных на эти насосы.

Введение

Acinetobacter baumannii является наиболее приоритетным патогеном Всемирной организации здравоохранения из-за его устойчивости ко всем классам антибиотиков¹. Это условно-патогенный микроорганизм, поражающий в основном госпитализированных, травмированных или людей с ослабленным иммунитетом. A. baumannii в значительной степени уклоняется от антибиотиков с помощью насосов, наиболее актуальными из которых является семейство экспортеров резистентно-узелкового деления (RND)². Понимание того, как эти насосы работают механически, позволит разработать целевые терапевтические варианты.

протокол

1. Подготовка эксперимента

1. Очистите плазмиду pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (инсерционная плазмида, рис. 2A) с интересующим геном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь нас интересует ген adeIJK. Конечная концентрация плазмиды должна составлять ≥100 нг/мкл.
2. Очистите вспомогательную плазмиду (pTNS2)⁹ и эксцизионную плазмиду (pFLP2^ab)⁶ (рис. 2B, C, соответственно), в идеале до конечной концентрации плазмидной ДНК ≥100 нг/мкл.
3. Приготовьте 50 мл стерильной сверхчистой воды и 25 мл с....

Результаты

Процедура хромосомного введения занимает всего 2 часа в течение 3 дней, чтобы увидеть результат - колонии, растущие на селективной агаровой пластине (рис. 1A-C). Ожидаемое число колоний на трансформационной пластине зависит от деформации: можно увидеть 20-3.......

Обсуждение

Несмотря на то, что эта процедура хромосомной вставки индуцируемой системы экспрессии генов с одной копией у A. baumannii технически проста и не трудоемка, необходимо подчеркнуть несколько важных этапов. Во-первых, подготовка компетентных клеток должна производиться на льду, насколько.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates