Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией

Резюме

Мы описываем простую процедуру однокопийной хромосомной комплементации гена насоса оттока с использованием системы экспрессии на основе mini-Tn7 в сконструированный штамм Acinetobacter baumannii с дефицитом эффлюкса. Этот точный генетический инструмент позволяет контролировать экспрессию генов, что является ключом к характеристике насосов оттока у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация

Acinetobacter baumannii признан опасным грамотрицательным патогеном из-за его широкой устойчивости к антибиотикам. Крайне важно понять механизмы, лежащие в основе этой резистентности, чтобы разработать новые и эффективные терапевтические варианты. К сожалению, наша способность исследовать эти механизмы у A. baumannii ограничена нехваткой подходящих инструментов для генетических манипуляций. В данной работе мы описываем методы использования хромосомной системы на основе мини-Tn7 для достижения однокопийной экспрессии гена у штамма A. baumannii , у которого отсутствуют функциональные механизмы оттока типа RND. Однокопийная вставка и индуцированная экспрессия насоса эффлюкса весьма выгодны, так как присутствие оперонов оттока RND на плазмидах с высоким числом копий часто плохо переносится бактериальными клетками. Кроме того, включение рекомбинантных векторов экспрессии мини-Tn7 в хромосому суррогатного хозяина A. baumannii с повышенной чувствительностью к эффлюксу помогает обойти помехи от других насосов оттока. Эта система полезна не только для исследования неохарактеризованных насосов бактериального оттока, но и для оценки эффективности потенциальных ингибиторов, нацеленных на эти насосы.

Введение

Acinetobacter baumannii является наиболее приоритетным патогеном Всемирной организации здравоохранения из-за его устойчивости ко всем классам антибиотиков¹. Это условно-патогенный микроорганизм, поражающий в основном госпитализированных, травмированных или людей с ослабленным иммунитетом. A. baumannii в значительной степени уклоняется от антибиотиков с помощью насосов, наиболее актуальными из которых является семейство экспортеров резистентно-узелкового деления (RND)². Понимание того, как эти насосы работают механически, позволит разработать целевые терапевтические варианты.

Одним из распространенных способов, с помощью которых клеточные процессы могут быть конкретно различимы, является генетическая манипуляция. Тем не менее, инструменты, доступные для генетических исследований A. baumannii, ограничены, и, чтобы еще больше запутать дизайн эксперимента, клинические изоляты часто устойчивы к антибиотикам, обычно используемым для селекции при^{генетических} манипуляциях. Второе препятствие, с которым приходится сталкиваться при изучении насосов оттока, заключается в том, что они строго регулируются, часто неизвестными факторами, что затрудняет точную изоляцию и приписывание функций^{одному насосу}. Видя необходимость расширения исследовательского инструментария, мы разработали индуцируемую экспрессирующую систему на основе mini-Tn7, включающую кассету с рекомбиназной мишенью Flp (FRT), которая позволяет удалить маркер выбора ^5,6,7 (рис. 1). Эта элегантная система клонирования и экспрессии, впервые созданная для Pseudomonas ^8,9,10, была использована для генерации однокопийных комплементов насоса оттока в штамм A. baumannii с дефицитом насоса RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: далее — A. baumannii AB258), который мы сгенерировали¹¹. Имея возможность изучать один насос оттока за раз и не перегружать бактериальные клетки высокой экспрессией (как это обычно наблюдается в системах экспрессии на основе плазмид), можно лучше узнать о критических, физиологических аспектах каждого насоса оттока с минимальным вмешательством и меньшим количеством осложнений.

В данной статье описывается, как использовать систему mini-Tn7 для дополнения удаленного гена, представляющего интерес, RND efflux pump adeIJK, в хромосому A. baumannii AB258 с помощью серии неосложненных шагов, выполняемых в течение 9 дней⁷. Первый набор этапов заключается в повторном введении удаленных генов насоса оттока, клонированных в инсерционную плазмиду на основе мини-Tn7 (рис. 2A) в единственномместе вставки Tn7 после хорошо консервативного гена glmS (рис. 3A). Этому процессу способствует нерепликативная плазмида-хелпер (рис. 2B), которая кодирует гены транспозазы, необходимые для инсертации, управляемой Tn7. Во втором наборе этапов используется эксцизионная плазмида (рис. 2C) для Flp-рекомбиназного удаления гена гентамицина, окруженного сайтами FRT (рис. 3B) для создания немаркированного штамма. Несмотря на то, что эта система используется для выяснения существенной роли и возможных ингибиторов насосов RND в отношении устойчивости к антибиотикам, она может быть использована для исследования любого интересующего гена.

протокол

1. Подготовка эксперимента

1. Очистите плазмиду pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (инсерционная плазмида, рис. 2A) с интересующим геном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь нас интересует ген adeIJK. Конечная концентрация плазмиды должна составлять ≥100 нг/мкл.
2. Очистите вспомогательную плазмиду (pTNS2)⁹ и эксцизионную плазмиду (pFLP2^ab)⁶ (рис. 2B, C, соответственно), в идеале до конечной концентрации плазмидной ДНК ≥100 нг/мкл.
3. Приготовьте 50 мл стерильной сверхчистой воды и 25 мл стерильного бульона LB (Lennox) (см. Таблицу материалов).
4. Подготовьте не менее 10 LB-агаровых пластин, каждая из которых содержит следующие добавки: обычная (без добавок), гентамицин (Gm) в концентрации 50 мкг/мл, карбенициллин (Cb) в концентрации 200 мкг/мл (для отбора по гену резистентности к ампициллину) и 5% сахарозы (см. Таблицу материалов).
5. Штамм для индикации на LB-агар вытесняют и инкубируют при 37 °C в течение 16-18 ч. Здесь используют A. baumannii AB258.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен выполняться в максимально возможной стерильной среде с использованием горелки Бунзена на столе или в шкафу биологической безопасности. Все расходные материалы (наконечники для пипеток, петли для инокуляции, пробирки для микрофуги и т.д.) должны быть стерильными.

2. Подготовка культуры

1. Инокулируют одну колонию A. baumannii AB258 в 4 мл бульона LB в стерильную культуральную пробирку объемом 13 мл, используя стерильную инокуляционную петлю или стерильную деревянную инокуляционную палочку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного образца и одного контроля используется одна культура объемом 4 мл. Увеличьте количество культур в зависимости от необходимого количества образцов.
2. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C при встряхивании (250 об/мин).
3. Поместите бутылку со стерильной дистиллированной водой (25-50 мл) при температуре 4 °C на ночь для использования на шаге 3.

3. Подготовка электрокомпетентных ячеек

1. Поместите все стерильные пробирки для микрофуги объемом 1,5 мл (по две на культуру) и стерильные кюветы для электропорации (по две на культуру) на лед (см. Таблицу материалов). Держите образцы на льду как можно дольше на протяжении всей процедуры.
2. Поместите бутылку со стерильной водой, которая хранилась при температуре 4 °C, на лед.
3. Переложите 1,5 мл бактериальной культуры на ночь в одну из пробирок для микрофуги объемом 1,5 мл.
4. Центрифугу при 13 000 x g в течение 2 мин для гранулирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование в идеале должно выполняться при 4 °C, но центрифугирование при температуре окружающей среды приемлемо и не вредно.
5. С помощью пипетки объемом 1 мл удалите всю надосадочную жидкость, не повредив гранулы клеток.
6. Добавьте еще 1,5 мл бактериальной культуры в ту же пробирку с микрофугой. Центрифуга при 13 000 x g в течение 2 мин, затем удалите весь надосадочную жидкость.
7. Повторите шаг 3,6 в последний раз с оставшимся 1 мл культуры.
8. Добавьте 1 мл ледяной стерильной воды в гранулу клетки и суспендируйте с помощью осторожного пипетирования до тех пор, пока гранула не перестанет оставаться на дне пробирки с микрофугой.
9. Центрифугируют ресуспендированные клетки при 13 000 x g в течение 2 мин.
10. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Не сливайте надосадочную жидкость, особенно на последующих этапах промывки, когда клетки имеют тенденцию образовывать менее компактные гранулы.
11. Повторите этот шаг промывки ледяной стерильной водой, шаги 3.8–3.10, еще дважды.
12. Аккуратно ресуспендируйте готовую клеточную гранулу в 200 мкл ледяной стерильной воды.
13. Переложите 100 мкл конечной клеточной суспензии во вторую ледяную пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл. Эта вторая аликвота станет отрицательным регулятором для электропорации. Храните образцы клеток на льду.

4. Электропорация

1. Предварительно подогреть 1 мл бульона LB и одну пластину с агаром LB +^{Gm 50} (приготовленную на шаге 1.4) для каждого образца и контролировать в статическом инкубаторе, установленном до 37 °C.
2. В комбинированном объеме 5 мкл или менее добавьте по 100-200 нг плазмиды-хелпера pTNS2 и инсерционной плазмиды pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK к аликвоте электрокомпетентных клеток.
3. Перемешайте легким постукиванием кончиками пальцев, чтобы обеспечить полное смешивание плазмид с электрокомпетентными клетками без образования пузырьков.
4. Добавьте эквивалентный объем стерильной дистиллированной воды в аликвоту ячейки с отрицательным контролем и осторожно перемешайте, как указано выше.
5. Инкубируют образцы на льду в течение 20 мин.
6. Перенесите весь образец клетки в ледяную электропорационную кювету, затем поместите кювету обратно на лед. Повторите то же самое для отрицательного образца контрольной ячейки.
7. Электропорируют образец ячейки.
   1. Включите электропоратор и установите его на напряжение 2,0 кВ (25 мкФ, 200 Ω) (см. Таблицу материалов).
   2. Протрите поверхность кюветы мягкой тканью, чтобы удалить налипший лед или влагу.
   3. Вставьте кювету в электропоратор и подайте удар током.
   4. Немедленно добавьте 0,9 мл предварительно подогретого бульона LB к клеткам в кювете и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать клетки со средой.
   5. Переложите всю клеточную суспензию в новую пробирку для микрофуги объемом 1,5 мл (комнатной температуры).
   6. Проверьте значение постоянной времени на электропораторе; Для достижения наилучших результатов это значение должно быть в диапазоне от 4 до 6.
8. Повторите процедуру электропорации (шаги 4.7.1 - 4.7.6) для отрицательного образца контрольной ячейки.
9. Инкубируют электропорированные образцы при 37 °C в течение 1 ч при 250 об/мин для восстановления клеток.
10. С помощью распределителя модификации распределите 100 мкл каждого образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +^{Gm 50} .
    1. Центрифугируют оставшиеся образцы при 13 000 x g в течение 2 мин, чтобы гранулировать клетки.
    2. Удалив всю надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл бульона LB.
    3. Распределите каждый образец целиком по отдельным предварительно нагретым пластинам из агара LB +^{Gm 50} .
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность электропорации может зависеть от деформации. При электропорации штамма в первый раз может быть информативно выделить различные объемы или даже разведения образца для электропорации, чтобы убедиться, что полученные планшеты имеют изолированные колонии.
11. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

5. Отбор трансформированных колоний для ПЦР-скрининга

1. Проверьте электропорационные пластины. Отрицательный контроль не должен иметь колоний; Образец должен иметь отчетливые колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты с колониями на этом этапе и на всех последующих этапах, где производятся агаровые пластины с колониями или заплатками, можно хранить при температуре 4 °C до 3 дней, прежде чем продолжить.
2. Используя стерильные зубочистки, возьмите до 10 отдельных колоний из агаровых пластин LB + Gm⁵⁰ и наложите их на свежую агаровую пластину LB + Gm⁵⁰ .
3. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

6. Верификация хромосомной вставки методом ПЦР колоний

1. Извлеките из инкубатора агаровые пластины LB + Gm⁵⁰ , содержащие заплатанные колонии.
2. С помощью стерильной зубочистки или стерильного наконечника пипетки удалите небольшую порцию (размером с большую колонию) из пластыря в 20 мкл стерильной дистиллированной воды в пробирке для ПЦР объемом 0,2 мл; Хорошо перемешайте. Образец воды должен заметно помутнеть по мере того, как клетки высвобождаются из зубочистки. Подготовьте любое количество образцов, которые необходимо пройти, но 6 должно быть достаточно.
3. Инкубируют ПЦР-пробирку, содержащую бактериальную суспензию, при 100 °С в течение 5-10 мин.
4. С помощью мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) вращайте образец с фиксированной максимальной скоростью в течение 2 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор.
5. Переложите надосадочную жидкость в новую ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл и поместите ее на лед. Этот образец содержит матричную ДНК для реакции ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту матричную ДНК можно хранить при -20 °C перед проведением ПЦР.
6. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ ABglmS2_F_New прямой праймер, 0,18 мкМ обратного праймера Tn7R (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте нематричный контроль (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК (см. таблицу материалов).
7. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 49 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
8. После добавления красителя, загружающего ДНК, до конечной концентрации 1x, загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 2% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 382.н. В NTC не должно быть полос.
9. Определите образцы, из которых был получен ожидаемый продукт ПЦР. Подготовьте полосчатую пластину на агаровых пластинах LB + Gm⁵⁰ из любого из ПЦР-положительных пластырей; выдерживают при 37 °С в течение 16-18 ч. Цель состоит в том, чтобы создать планшет с одиночными колониями для приготовления запаса глицерина для сохранения этого меченого штамма и в качестве отправной точки для создания немаркированного штамма (описанного ниже).

7. Удаление маркера Gm^R с помощью pFLP2^ab

1. Следуйте процедуре, описанной в шаге 2: Подготовка культуры. Образец, используемый для приготовления ночной культуры, представляет собой одну колонию из агаровых пластин LB + Gm⁵⁰ , подготовленную для получения дискретных колоний на стадии 6.9.
2. Следуйте процедуре, описанной в шаге 3: Подготовка электрокомпетентных ячеек. Подготовьте клетки из ночной культуры к электропорации.
3. Следуйте процедуре, описанной в шаге 4: Электропорация. В этом случае плазмидой, которую нужно ввести в клетки, является pFLP2^ab (100-200 нг), которая удаляет ген резистентности к гентамицину, фланкируя хромосомно вставленный ген, представляющий интерес.
4. После восстановления клеток в течение 1 ч (шаг 4.9) распределите 100 мкл образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +^{Cb 200} (приготовленную на стадии 1.4). Это селективное давление гарантирует, что будут расти только клетки, содержащие эксцизионную плазмиду pFLP2^ab .
5. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.
6. Проверьте пластину на наличие колоний. Отрицательная контрольная пластина не должна иметь колоний; планшет для образцов агара LB +^{Cb 200} должен иметь отчетливые колонии.
7. Используя стерильные зубочистки, наложите до 20 изолированных колоний на агаровую пластину LB + Cb²⁰⁰ и агаровую пластину LB + Gm⁵⁰ .
8. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
9. Проверьте пластины на наличие заплаток. У клонов, которые растут на агаровой пластине LB + Cb²⁰⁰ , но не на агаровой пластине LB + Gm⁵⁰ , ген резистентности к гентамицину был удален из оригинальной вставки.
10. Выберите пластыри, устойчивые к карбенициллину и чувствительные к гентамицину, для нанесения полос на отдельные пластины из агара LB, дополненные 5% (w/v) сахарозой, которая вызывает изгнание плазмиды pFLP2^ab из бактерий. Выберите до 10 колоний.
11. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
12. Проверьте таблички на наличие колоний.
13. В качестве окончательного подтверждения потери плазмиды pFLP2^ab следует перекрестно заплатить 4-6 изолированных колоний из 5% сахарозы на агаровую пластину LB + Cb²⁰⁰ и агаровую пластину LB.
14. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
15. Выберите клон, который растет на агаровой пластине LB и чувствителен к карбенициллину, для приготовления глицеринового материала для сохранения этого немаркированного штамма.
    1. Генетическая верификация немаркированного штамма может быть проведена с помощью ПЦР колонии (шаг 6: Проверка хромосомной вставки с помощью ПЦР колонии) с использованием праймеров, нацеленных на ген резистентности к гентамицину.
    2. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ Gm_F прямой праймер, 0,18 мкМ Gm_R обратный праймер (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте контрольный материал без матрицы (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК, и положительный контроль с использованием ДНК маркированного штамма.
    3. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 40 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
    4. После добавления красителя с загрузкой ДНК до конечной концентрации 1x загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 1% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 525.н. Положительный контроль должен иметь одну полосу; сэмплы и НТЦ не должны иметь полос.

Результаты

Процедура хромосомного введения занимает всего 2 часа в течение 3 дней, чтобы увидеть результат - колонии, растущие на селективной агаровой пластине (рис. 1A-C). Ожидаемое число колоний на трансформационной пластине зависит от деформации: можно увидеть 20-3...

Обсуждение

Несмотря на то, что эта процедура хромосомной вставки индуцируемой системы экспрессии генов с одной копией у A. baumannii технически проста и не трудоемка, необходимо подчеркнуть несколько важных этапов. Во-первых, подготовка компетентных клеток должна производиться на льду, насколько...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates