אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

Summary

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

Abstract

Acinetobacter baumannii מוכר כפתוגן גראם-שלילי מאתגר בשל עמידותו הנרחבת לאנטיביוטיקה. חיוני להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התנגדות זו כדי לעצב אפשרויות טיפוליות חדשות ויעילות. למרבה הצער, יכולתנו לחקור מנגנונים אלה ב- A. baumannii נפגעת על ידי מיעוט כלי מניפולציה גנטיים מתאימים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש במערכת כרומוזומלית מבוססת מיני-Tn7 להשגת ביטוי גנים בעותק יחיד בזן A. baumannii חסר מנגנוני אפלוקס פונקציונליים מסוג RND. החדרת עותק יחיד וביטוי משאבת אפלוקס מושרית הם יתרון למדי, מכיוון שנוכחותם של אופרוני אפלוקס RND על פלסמידים בעלי מספר העתק גבוה נסבלת לעתים קרובות בצורה גרועה על ידי תאי חיידקים. יתר על כן, שילוב וקטורי ביטוי מיני-Tn7 רקומביננטיים בכרומוזום של פונדקאי חלופי A. baumannii עם רגישות מוגברת לשטף מסייע לעקוף הפרעות ממשאבות אפלוקס אחרות. מערכת זו היא בעלת ערך לא רק לחקר משאבות אפלוקס חיידקיות לא מאופיינות אלא גם להערכת היעילות של מעכבים פוטנציאליים המכוונים למשאבות אלה.

Introduction

Acinetobacter baumannii הוא פתוגן בעדיפות עליונה של ארגון הבריאות העולמי בשל עמידותו המקיפה לכל סוגי האנטיביוטיקה¹. זהו פתוגן אופורטוניסטי המשפיע בעיקר על אנשים מאושפזים, פצועים או מדוכאי חיסון. A. baumannii מתחמק במידה רבה מאנטיביוטיקה באמצעות משאבות אפלוקס, הרלוונטית ביותר היא משפחת היצואנים Resistance-Nodulation-Division (RND)². הבנת האופן שבו משאבות אפלוקס אלה פועלות באופן מכניסטי תאפשר לפתח אפשרויות טיפוליות ממוקדות.

אחת הדרכים הנפוצות שבהן ניתן להבחין באופן ספציפי בין תהליכים תאיים היא באמצעות מניפולציה גנטית. עם זאת, הכלים הזמינים למחקרים גנטיים של A. baumannii מוגבלים, וכדי לבלבל עוד יותר את תכנון הניסוי, מבודדים קליניים עמידים לעתים קרובות לאנטיביוטיקה המשמשת באופן שגרתי לבחירה במניפולציות גנטיות³. משוכה שנייה בה נתקלים כאשר חוקרים משאבות אפלוקס באופן ספציפי היא שהן מווסתות בקפדנות - לעתים קרובות על ידי גורמים לא ידועים - מה שמקשה על בידוד מדויק וייחוס תפקוד למשאבה בודדת⁴. כשראינו את הצורך הזה להרחיב את ארגז הכלים של המחקר, פיתחנו מערכת ביטוי אינדוקטיבי מבוססת מיני-Tn7, חד-העתקה, המשלבת קלטת יעד רקומבינאז Flp (FRT), המאפשרת להסיר את סמן הבחירה ^5,6,7 (איור 1). מערכת השיבוט והביטוי האלגנטית הזו, שנוצרה לראשונה עבור Pseudomonas ^8,9,10, שימשה ליצירת משלים של משאבת אפלוקס בעותק יחיד לזן חסר משאבת אפלוקס RND של A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: להלן A. baumannii AB258) שיצרנו¹¹. היכולת לחקור משאבת אפלוקס אחת בכל פעם ולא להציף את תאי החיידקים בביטוי העתק גבוה (כפי שניתן לראות בדרך כלל במערכות ביטוי מבוססות פלסמיד), ניתן ללמוד טוב יותר על ההיבטים הפיזיולוגיים הקריטיים של כל משאבת אפלוקס עם הפרעה מינימלית וסיבוכים מופחתים.

מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במערכת mini-Tn7 כדי להשלים גן שנמחק, RND efflux pump adeIJK, לתוך הכרומוזום של A. baumannii AB258 באמצעות סדרה של צעדים לא מסובכים שבוצעו במהלך 9 ימים⁷. קבוצת השלבים הראשונה מציגה מחדש את הגנים שנמחקו של משאבת ה-efflux ששובטו לתוך פלסמיד החדרה מבוסס mini-Tn7 (איור 2A) באתר ההחדרה היחיד שלTn7 במורד הזרם של הגן glmS שהשתמר היטב (איור 3A). התהליך הזה מנוהל על-ידי פלסמיד עוזר לא משוכפל (איור 2B) שמקודד לגנים הטרנספוזאזים הדרושים להחדרה מונעת Tn7. קבוצת השלבים השנייה משתמשת בפלסמיד כריתה (איור 2C) להסרה בתיווך רקומבינאז של הגן גנטמיצין שמשני צדדיו אתרי FRT (איור 3B) כדי ליצור זן לא מסומן. למרות שמערכת זו משמשת להבהרת התפקידים החיוניים והמעכבים האפשריים של משאבות RND ביחס לעמידות לאנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כל גן מעניין.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

1. לטהר את פלסמיד pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (פלסמיד החדרה, איור 2A) עם הגן המעניין.
   הערה: כאן, הגן של עניין הוא adeIJK. ריכוז הפלסמיד הסופי צריך להיות ≥100 ng/μL.
2. טהרו את פלסמיד העזר (pTNS2)⁹ ואת פלסמיד הכריתה (pFLP2^ab)⁶ (איור 2B,C, בהתאמה), באופן אידיאלי לריכוז דנ"א פלסמיד סופי של ≥100 ננוגרם/μL.
3. הכינו 50 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים ו-25 מ"ל מרק LB סטרילי (לנוקס) (ראו טבלת חומרים).
4. הכינו לפחות צלחות אגר במשקל 10 ליברות, כל אחת עם התוספים הבאים: רגיל (ללא תוספים), גנטמיצין (גרם) ב-50 מיקרוגרם/מ"ל, קרבניצילין (Cb) ב-200 מיקרוגרם/מ"ל (לבחירה באמצעות גן עמידות לאמפיצילין) ו-5% סוכרוז (ראו טבלת חומרים).
5. יש להוציא את המתח לשימוש בהחדרה על אגר LB ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 16-18 שעות. כאן משתמשים ב-A. baumannii AB258.
   הערה: פרוטוקול זה חייב להתבצע בסביבה סטרילית ככל האפשר באמצעות מבער Bunsen בספסל או ארון בטיחות ביולוגי. כל החומרים המתכלים (קצוות פיפטה, לולאות חיסון, צינורות מיקרופוגה וכו ') צריכים להיות סטריליים.

2. הכנת תרבות

1. חסן מושבה אחת של A. baumannii AB258 לתוך 4 מ"ל של מרק LB בצינור תרבית סטרילי של 13 מ"ל באמצעות לולאת חיסון סטרילית או מקל חיסון סטרילי מעץ.
   הערה: תרבית יחידה של 4 מ"ל משמשת עבור דגימה אחת ובקרה אחת. הגדל את מספר התרביות בהתאם למספר הדגימות הדרושות.
2. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם רעידות (250 סל"ד).
3. הניחו בקבוק מים מזוקקים סטריליים (25-50 מ"ל) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לשימוש בשלב 3.

3. הכנת תאים electrocompetent

1. הניחו את כל צינורות המיקרופוגה הסטריליים בנפח 1.5 מ"ל (שניים לכל תרבית) ואת קוביות האלקטרופורציה הסטריליות (שתיים בכל תרבית) על קרח (ראו טבלת חומרים). שמור את הדגימות על קרח ככל האפשר לאורך כל ההליך.
2. מניחים את בקבוק המים הסטריליים שאוחסן ב -4 מעלות צלזיוס על קרח.
3. מעבירים 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים בן לילה לאחד מצינורות המיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
   הערה: צנטריפוגה תבוצע באופן אידיאלי ב -4 מעלות צלזיוס, אך צנטריפוגה בטמפרטורת הסביבה מקובלת ואינה מזיקה.
5. בעזרת פיפטה בנפח 1 מ"ל, מסירים את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
6. הוסף עוד 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים לתוך אותו צינור microfuge. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל supernatant.
7. חזור על שלב 3.6 פעם אחת אחרונה עם 1 מ"ל התרבות הנותרים.
8. הוסף 1 מ"ל של מים סטריליים קרים כקרח לגלולת התא והשהה מחדש עם פיפטינג עדין עד שהגלולה כבר לא יושבת בתחתית צינור המיקרופוגה.
9. צנטריפוגה את התאים המרחפים מחדש ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות.
10. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אין לשפוך את supernatant, במיוחד בשלבי השטיפה הבאים כאשר התאים נוטים ליצור כדוריות פחות קומפקטיות.
11. חזור על שלב השטיפה עם מים סטריליים קרים כקרח, שלבים 3.8 עד שלב 3.10, פעמיים נוספות.
12. יש להשהות מחדש בעדינות את גלולת התא הסופית ב-200 מיקרוליטר מים סטריליים קרים כקרח.
13. העבר 100 μL של תרחיף התא הסופי לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל השני קר כקרח. אליקוט שני זה יהפוך לשליטה השלילית להתחשמלות. שמור את דגימות התאים על קרח.

4. אלקטרופורציה

1. חם מראש 1 מ"ל של מרק LB ו LB אחד + Gm⁵⁰ צלחת אגר (מוכן בשלב 1.4) עבור כל דגימה ובקרה באינקובטור סטטי להגדיר 37 ° C.
2. בנפח משולב של 5 μL או פחות, הוסף 100-200 ng כל אחד מפלסמיד pTNS2 עוזר ואת פלסמיד החדרת pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK לאליציטוט של תאים אלקטרו-מוכשרים.
3. ערבבו בהקשה עדינה על קצות האצבעות כדי להבטיח ערבוב מלא של הפלסמידים עם התאים החשמליים מבלי להכניס בועות.
4. מוסיפים נפח שווה ערך של מים מזוקקים סטריליים לתא הבקרה השלילי aliquot ומערבבים בעדינות כנ"ל.
5. לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.
6. מעבירים את כל דגימת התא לקובט אלקטרופורציה קר כקרח, ואז מניחים את הקובט בחזרה על קרח. חזור על הפעולה עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
7. אלקטרופורציה של דגימת התא.
   1. הפעל את האלקטרופורטור והגדר אותו ל- 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (ראה טבלת חומרים).
   2. נגבו את פני השטח של הקובט עם רקמה רכה כדי להסיר קרח או לחות שנדבקו.
   3. הכנס את הקובט לתוך האלקטרופורטור וספק את השוק החשמלי.
   4. הוסיפו מיד 0.9 מ"ל של מרק LB שחומם מראש לתאים בקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם התקשורת.
   5. מעבירים את כל מתלה התא לצינור מיקרופוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל (טמפרטורת החדר).
   6. בדוק את הערך קבוע הזמן על electroporator; לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ערך זה צריך להיות בין 4 ל- 6.
8. חזור על הליך האלקטרופורציה (שלבים 4.7.1 עד שלב 4.7.6) עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
9. יש לדגור על הדגימות המחושמלות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ב-250 סל"ד כדי לאפשר התאוששות תאים.
10. בעזרת מפזר חיסון, פזרו 100 מיקרוליטר מכל דגימת תא מחושמל על צלחת אגר LB + Gm⁵⁰ שחוממה מראש.
    1. צנטריפוגה את הדגימות הנותרות ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
    2. לאחר הסרת כל supernatant באמצעות פיפטה, להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של מרק LV.
    3. יש למרוח כל דגימה על צלחות אגר LB + Gm^שחוממו מראש.
       הערה: יעילות אלקטרופורציה יכולה להיות תלוית מתח. כאשר מחשמלים זן בפעם הראשונה, זה יכול להיות אינפורמטיבי להוציא נפחים שונים, או אפילו דילולים, של דגימת האלקטרופורציה כדי להבטיח שללוחות המתקבלים יש מושבות מבודדות.
11. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

5. בחירת מושבות מותמרות לסינון מבוסס PCR

1. בדוק את לוחות האלקטרופורציה. לשליטה השלילית לא צריכות להיות מושבות; למדגם צריכות להיות מושבות נפרדות.
   הערה: צלחות עם מושבות, בשלב זה ובכל השלבים הבאים שבהם מיוצרים צלחות אגר עם מושבות או טלאים, ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים לפני שתמשיך.
2. באמצעות קיסמים סטריליים, הרימו עד 10 מושבות בודדות מצלחות האגר LB + Gm⁵⁰ והדביקו אותן על צלחת אגר LB + Gm⁵⁰ טרייה.
3. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

6. אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה

1. הסר את צלחות האגר LB + Gm⁵⁰ המכילות את המושבות המטולאות מהאינקובטור.
2. באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה סטרילי, להסיר חלק קטן (בערך בגודל של מושבה גדולה) מטלאי לתוך 20 μL של מים מזוקקים סטריליים בצינור PCR 0.2 מ"ל; מערבבים היטב. דגימת המים אמורה להיות עכורה לעין כאשר התאים משתחררים מהקיסם. הכינו כל מספר של דגימות שצריך לסנן, אבל 6 צריך להיות מספיק.
3. יש לדגור על צינור ה-PCR המכיל את התרחיף החיידקי בטמפרטורה של 100°C למשך 5-10 דקות.
4. באמצעות מיני-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), סובבו את הדגימה במהירות המרבית הקבועה למשך 2 דקות כדי להשליך פסולת תאית.
5. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור PCR חדש בנפח 0.2 מ"ל ומניחים אותו על קרח. דגימה זו מכילה את ה- DNA של התבנית עבור תגובת PCR.
   הערה: ניתן לאחסן DNA של תבנית זו בטמפרטורה של -20°C לפני שתמשיך עם PCR.
6. הכן תערובת תגובת PCR המכילה מאגר פולימראז 1x, 200 μM dNTPs, פריימר קדמי ABglmS2_F_New 0.18 μM, פריימר הפוך 0.18 μM Tn7R (טבלה 1), U אחד של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC), כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית (ראה טבלת חומרים).
7. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 49 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
8. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש להעמיס 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 2% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 382 bp. ל-NTC לא צריכות להיות להקות.
9. זהה את הדגימות שהפיקו את מוצר ה- PCR הצפוי. הכינו צלחת פסים על LB + Gm⁵⁰ צלחות אגר מכל אחד מהמדבקות החיוביות PCR; לדגור ב 37 ° C במשך 16-18 שעות. המטרה היא ליצור צלחת עם מושבות בודדות להכנת מלאי גליצרול לשימור זן מסומן זה וכנקודת מוצא ליצירת זן לא מסומן (המתואר להלן).

7. הסרתסמן^{Gm R} באמצעות pFLP2^ab

1. בצע את ההליך המוזכר בשלב 2: הכנת תרבית. הדגימה המשמשת להכנת תרבית הלילה היא מושבה בודדת מלוחות אגר LB + Gm⁵⁰ שהוכנו ליצירת מושבות נפרדות בשלב 6.9.
2. בצע את ההליך המוזכר בשלב 3: הכנת תאים electrocompetent. הכינו את התאים מתרבית הלילה להתחשמלות.
3. בצע את ההליך המוזכר בשלב 4: אלקטרופורציה. כאן, הפלסמיד שיש להכניס לתאים הוא pFLP2^ab (100-200 ng), אשר יסיר את גן העמידות לגנטמיצין, האגף את הגן המוחדר כרומוזומלית של עניין.
4. לאחר שהתאים התאוששו במשך שעה אחת (שלב 4.9), פזרו 100 μL של דגימת התא המחושמל על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ שחוממה מראש (שהוכנה בשלב 1.4). לחץ סלקטיבי זה מבטיח שרק תאים המכילים את פלסמיד הכריתה pFLP2^ab יגדלו.
5. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.
6. בדוק את הצלחת עבור מושבות. לצלחת הבקרה השלילית לא צריכות להיות מושבות; צלחת מדגם LB + Cb²⁰⁰ אגר צריכה להיות מושבות נפרדות.
7. באמצעות קיסמים סטריליים, הצליבו עד 20 מושבות מבודדות על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ וצלחת אגר LB + Gm⁵⁰ .
8. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
9. בדוק את הצלחות עבור טלאים. לשיבוטים שגדלים על צלחת האגר LB + Cb²⁰⁰ אך לא על צלחת האגר LB + Gm⁵⁰ הוסר גן העמידות לגנטמיצין מהתוספת המקורית.
10. בחר את המדבקות העמידות בפני קרבניצלין וגנטמיצין רגישות לפסים על צלחות אגר LB בודדות בתוספת 5% (w/v) סוכרוז, מה שמאלץ את גירוש פלסמיד pFLP2^ab מהחיידקים. בחר עד 10 מושבות.
11. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
12. בדוק את הצלחות עבור מושבות.
13. כאישור סופי לאובדן פלסמיד pFLP2^ab , הצליבו טלאי 4-6 מושבות מבודדות מלוחות הסוכרוז 5% על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ וצלחת אגר LB.
14. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
15. בחר שיבוט שגדל על צלחת אגר LB, וזה קרבניצלין רגיש להכנת מלאי גליצרול כדי לשמר את הזן הלא מסומן הזה.
    1. אימות גנטי של הזן הבלתי מסומן יכול להתבצע באמצעות PCR מושבה (שלב 6: אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה) באמצעות פריימרים המכוונים לגן עמידות לגנטמיצין.
    2. הכינו תערובת תגובת PCR המכילה 1x פולימראז באפר, 200 μM dNTPs, 0.18 μM Gm_F פריימר קדמי, 0.18 μM Gm_R פריימר הפוך (טבלה 1), 1U של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC) כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית, ובקרה חיובית באמצעות DNA מהזן המסומן.
    3. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 40 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
    4. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש לטעון 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 1% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 525 bp. השליטה החיובית צריכה להיות להקה אחת; הדגימות וה- NTC לא צריכות להיות להקות.

תוצאות

הליך החדרת הכרומוזומלי לוקח רק שעתיים בסך הכל במשך 3 ימים כדי לראות מושבות תוצאה גדלות על לוחית אגר סלקטיבית (איור 1A-C). מספר המושבות הצפוי על לוח הטרנספורמציה תלוי במתח: ניתן לראות 20-30 או אפילו מאות מושבות שכן החדרת Tn7 באתרי attTn7 היא ספציפית ויעילה

Discussion

אף על פי שהליך זה להחדרה כרומוזומלית של מערכת ביטוי גנים חד-עותקית מושרית ב- A. baumannii הוא פשוט מבחינה טכנית ואינו דורש עבודה רבה, ישנם מספר שלבים חשובים שיש לשים עליהם דגש. ראשית, הכנת התאים המוסמכים צריכה להיעשות על קרח ככל האפשר מכיוון שהתאים הופכים שבירים במהלך החלפת המדיה במים קרים כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates