Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Özet

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Özet

Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii'deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.

Giriş

Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün en öncelikli patojenidir¹. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir². Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.

Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir³. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyi^{zorlaştırır 4}. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi ^5,6,7'nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas ^8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii'nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı¹¹. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.

Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258'in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK'yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır⁷. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.

Protokol

1. Deneysel hazırlık

1. Plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm^9'u (ekleme plazmidi, Şekil 2A) ilgilenilen gen ile saflaştırın.
   NOT: Burada ilgilenilen gen adeIJK'dir. Nihai plazmit konsantrasyonu ≥100 ng/μL olmalıdır.
2. Yardımcı plazmidi (pTNS2)⁹ ve eksizyon plazmidini (pFLP2^ab)⁶ (Şekil 2B,C, sırasıyla), ideal olarak ≥100 ng/μL'lik bir nihai plazmit DNA konsantrasyonuna kadar saflaştırın.
3. 50 mL steril ultra saf su ve 25 mL steril LB (Lennox) suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Her biri aşağıdaki katkı maddelerini içeren en az 10 LB agar plakası hazırlayın: sade (katkı maddesi yok), 50 μg/mL'de gentamisin (Gm), 200 μg/mL'de karbenisilin (Cb) (ampisilin direnç geni yoluyla seçim için) ve %5 sükroz (bkz.
5. LB agar üzerine yerleştirmek için kullanılacak suşu çizgiden çıkarın ve 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Burada A. baumannii AB258 kullanılır.
   NOT: Bu protokol, mümkün olduğunca steril bir ortamda, tezgahta bir Bunsen brülörü veya biyolojik güvenlik kabini kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm sarf malzemelerinin (pipet uçları, aşılama halkaları, mikrofüj tüpleri vb.) steril olması gerekir.

2. Kültür hazırlığı

1. Tek bir A. baumannii AB258 kolonisini, steril bir aşılama döngüsü veya steril ahşap aşılama çubuğu kullanarak steril bir 13 mL kültür tüpünde 4 mL LB suyuna aşılayın.
   NOT: Bir numune ve bir kontrol için tek bir 4 mL kültür kullanılır. İhtiyaç duyulan numune sayısına bağlı olarak kültür sayısını artırın.
2. Gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.
3. 3. adımda kullanmak için gece boyunca 4 °C'de bir şişe steril damıtılmış su (25-50 mL) yerleştirin.

3. Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması

1. Tüm steril 1.5 mL mikrofüj tüplerini (kültür başına iki adet) ve steril elektroporasyon küvetlerini (kültür başına iki adet) buz üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri prosedür boyunca mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
2. 4 °C'de saklanan steril su şişesini buzun üzerine koyun.
3. Gece boyunca bakteri kültürünün 1.5 mL'sini 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinden birine aktarın.
4. Hücreleri peletlemek için 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüjleme ideal olarak 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak ortam sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir ve zararlı değildir.
5. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın.
6. Aynı mikrofüj tüpüne 1.5 mL daha bakteri kültürü ekleyin. 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin, ardından tüm süpernatanı çıkarın.
7. Kalan 1 mL kültürle 3.6 adımını son bir kez tekrarlayın.
8. Hücre peletine 1 mL buz gibi steril su ekleyin ve pelet artık mikrofüj tüpünün dibinde kalmayana kadar hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin.
9. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.
10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatanı, özellikle hücrelerin daha az kompakt topaklar oluşturma eğiliminde olduğu sonraki yıkama adımlarında dökmeyin.
11. Bu yıkama adımını buz gibi steril suyla, 3.8'den 3.10'a kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.
12. Son hücre peletini 200 μL buz gibi steril suda nazikçe yeniden süspanse edin.
13. Son hücre süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci buz gibi soğuk 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu ikinci alikot, elektroporasyon için negatif kontrol olacaktır. Hücre örneklerini buz üzerinde tutun.

4. Elektroporasyon

1. Her numune için 1 mL LB et suyu ve bir LB + Gm⁵⁰ agar plakası (adım 1.4'te hazırlanmıştır) önceden ısıtın ve 37 °C'ye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin.
2. 5 μL veya daha az birleşik bir hacimde, pTNS2 yardımcı plazmidinin her birine 100-200 ng ekleyin ve pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK ekleme plazmiti, elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin.
3. Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.
4. Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki gibi hafifçe karıştırın.
5. Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
6. Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın, ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol hücresi örneği için tekrarlayın.
7. Hücre örneğini elektroporate edin.
   1. Elektroporatörü açın ve 2.0 kV'a (25 μF, 200 Ω) ayarlayın (bkz.
   2. Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin.
   3. Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.
   4. Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mL önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   5. Tüm hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne (oda sıcaklığı) aktarın.
   6. Elektroporatör üzerindeki zaman sabiti değerini kontrol edin; En iyi sonuçlar için bu değer 4 ile 6 arasında olmalıdır.
8. Negatif kontrol hücresi numunesi için elektroporasyon prosedürünü tekrarlayın (adım 4.7.1 ila adım 4.7.6).
9. Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 °C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.
10. Bir aşılama yayıcı kullanarak, her bir elektroporasyonlu hücre örneğinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına yayın.
    1. Hücreleri peletlemek için kalan numuneleri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    2. Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 μL LB et suyunda yeniden süspanse edin.
    3. Her bir numunenin tamamını önceden ısıtılmış ayrı ayrı LB + Gm⁵⁰ agar plakalarına yayın.
       NOT: Elektroporasyon verimliliği gerilime bağlı olabilir. Bir suşun ilk kez elektropolasyonu yapılırken, elde edilen plakaların izole kolonilere sahip olduğundan emin olmak için elektroporasyon numunesinin farklı hacimlerini ve hatta seyreltmelerini plakalamak bilgilendirici olabilir.
11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

5. PCR tabanlı tarama için dönüştürülmüş kolonilerin seçilmesi

1. Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Negatif kontrolün kolonisi olmamalıdır; Numunenin farklı kolonileri olmalıdır.
   NOT: Kolonili plakalar, bu adımda ve kolonili veya yamalı agar plakalarının üretildiği sonraki tüm adımlarda, devam etmeden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
2. Steril kürdan kullanarak, LB + Gm⁵⁰ agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına yamalayın.
3. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

6. Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması

1. Yamalı kolonileri içeren LB + Gm⁵⁰ agar plakalarını inkübatörden çıkarın.
2. Steril bir kürdan veya steril pipet ucu kullanarak, bir yamadan küçük bir kısmı (yaklaşık büyük bir koloni büyüklüğünde) 20 mL'lik bir PCR tüpünde 0.2 μL steril damıtılmış suya çıkarın; İyice karıştırın. Hücreler kürdandan salınırken su numunesi gözle görülür şekilde bulanıklaşmalıdır. Taranması gereken herhangi bir sayıda numune hazırlayın, ancak 6 yeterli olmalıdır.
3. Bakteriyel süspansiyonu içeren PCR tüpünü 100 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
4. Bir mini santrifüj kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücresel kalıntıları peletlemek için numuneyi 2 dakika boyunca sabit maksimum hızda döndürün.
5. Süpernatanı yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu numune, PCR reaksiyonu için şablon DNA'yı içerir.
   NOT: Bu şablon DNA, PCR'ye devam etmeden önce -20 °C'de saklanabilir.
6. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP'ler, 0.18 μM ABglmS2_F_New ileri primer, 0.18 μM Tn7R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın hazırlanan şablon DNA toplam 25 μL hacimde. Şablon DNA hariç tümü dahil olmak üzere şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın (bkz.
7. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 49 °C ve 30 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
8. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 2'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 382 bp'dir. NTC'nin bantları olmamalıdır.
9. Beklenen PCR ürününü üreten numuneleri tanımlayın. PCR pozitif yamaların herhangi birinden LB + Gm⁵⁰ agar plakaları üzerinde bir çizgi plakası hazırlayın; 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Amaç, bu işaretli suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için ve işaretsiz bir suş oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak tek kolonili bir plaka oluşturmaktır (aşağıda açıklanmıştır).

7.pFLP2 ab kullanılarak Gm^R işaretleyicisinin çıkarılması

1. Adım 2'de belirtilen prosedürü izleyin: Kültür hazırlama. Gece kültürünü hazırlamak için kullanılan numune, adım 6.9'da ayrı koloniler oluşturmak için hazırlanan LB + Gm⁵⁰ agar plakalarından tek bir kolonidir.
2. Adım 3'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektrokompetan hücrelerin hazırlanması. Elektroporasyon için gece kültüründen hücreleri hazırlayın.
3. Adım 4'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektroporasyon. Burada, hücrelere sokulacak plazmit, ilgilenilen kromozomal olarak yerleştirilmiş geni çevreleyen gentamisin direnç genini ortadan kaldıracak olan pFLP2^ab'dir (100-200 ng).
4. Hücreler 1 saat boyunca iyileştikten sonra (adım 4.9), elektroporasyonlu hücre numunesinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına (adım 1.4'te hazırlanır) yayın. Bu seçici basınç, yalnızca pFLP2^ab eksizyon plazmidini barındıran hücrelerin büyümesini sağlar.
5. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
6. Plakada koloni olup olmadığını kontrol edin. Negatif kontrol plakasında koloni olmamalıdır; LB + Cb²⁰⁰ agar numune plakası farklı kolonilere sahip olmalıdır.
7. Steril kürdan kullanarak, 20'ye kadar izole koloniyi bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına ve bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına çapraz yamalayın.
8. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
9. Plakalarda yama olup olmadığını kontrol edin. LB + Cb²⁰⁰ agar plakasında büyüyen, ancak LB + Gm⁵⁰ agar plakasında büyümeyen klonlar, gentamisin direnç genini orijinal ek parçadan çıkarmıştır.
10. pFLP2^ab plazmidinin bakterilerden atılmasını zorlayan% 5 (a / h) sükroz ile desteklenmiş ayrı LB agar plakalarına çizilmeye duyarlı karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı yamaları seçin. En fazla 10 koloni seçin.
11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
12. Koloniler için plakaları kontrol edin.
13. pFLP2^ab plazmit kaybının son bir teyidi olarak,% 5 sükroz plakalarından izole edilmiş 4-6 koloniyi bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına ve bir LB agar plakasına çapraz yamalayın.
14. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
15. LB agar plakasında büyüyen ve bu işaretsiz suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için karbenisiline duyarlı bir klon seçin.
    1. İşaretlenmemiş suşun genetik doğrulaması, gentamisin direnç genini hedef alan primerler kullanılarak koloni PCR (adım 6: Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması) ile gerçekleştirilebilir.
    2. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0.18 μM Gm_F ileri primer, 0.18 μM Gm_R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL toplam 25 μL hacimde hazırlanan şablon DNA içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Şablon DNA hariç tümünü içeren şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın, ve işaretli suştan DNA kullanılarak pozitif bir kontrol.
    3. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 50 °C ve 40 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
    4. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 1'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 525 bp'dir. Pozitif kontrol tek bir banda sahip olmalıdır; numuneler ve NTC'de bant olmamalıdır.

Sonuçlar

Kromozomal yerleştirme prosedürü, seçici bir agar plakasında büyüyen bir sonuç kolonisi görmek için 3 gün boyunca toplam sadece 2 saat sürer (Şekil 1A-C). Dönüşüm plakasında beklenen koloni sayısı suşa bağlıdır: Tn7'nin attTn7 bölgelerine yerleştirilmesi spesifik ve verimli olduğu için 20-30 hatta yüzlerce koloni görülebilir⁹. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması (

Tartışmalar

A. baumannii'de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates