原代小鼠 CD8+ T 细胞的实时体外迁移测定

摘要

该协议提供了一种在特定环境条件下进行原代小鼠T细胞分离的方法和T细胞迁移的延时显微镜检查，并进行了定量分析。

摘要

适应性免疫反应依赖于 T 细胞在血液、淋巴和组织中迁移以响应病原体和异物的能力。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要协调来自环境和局部免疫细胞的许多信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和粘附分子。此外，T 细胞运动受周围动态环境线索的影响，这些线索可以改变激活状态、转录景观、粘附分子表达等。 在体内，这些看似交织在一起的因素的复杂性使得很难区分有助于T细胞迁移的单个信号。该协议提供了从T细胞分离到计算机辅助分析的一系列方法，以在高度特定的环境条件下实时评估T细胞迁移。这些条件可能有助于阐明调节迁移的机制，提高我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制证据。更深入地了解影响细胞迁移的分子相互作用对于开发改进的治疗方法非常重要。

引言

T细胞是适应性抗原特异性免疫反应的主要效应因子。在群体水平上，T细胞是异质的，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。重要的是，CD8+ T 细胞是免疫系统的主要细胞溶解效应因子，可直接消除感染或功能失调的细胞¹。

成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴管循环以寻找抗原。在感染过程中，T 细胞在血液或组织中呈递抗原，并迅速流向脾脏或最近的引流淋巴结，开始产生有效的免疫反应。在任何一种情况下，T细胞都会被激活，进行克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液，如果还没有的话。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体下调，并上调许多对组织特异性迁移至关重要的整合素和趋化因子受体²。最终，T 细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号传导在内的收敛环境信号驱动的。

趋化因子大致可分为两大类:（1） 稳态信号，对分化、存活和基础功能至关重要，以及 （2） 炎症信号，如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，是趋化性所必需的。通常，趋化因子除了激活整合素表达外，还会产生驱动定向迁移的信号梯度，称为趋化性¹。趋化性受到精细调节且高度敏感，T细胞能够对梯度的微小变化做出反应，这些变化可以引导它们朝向特定方向或位置。

除了这些 T 细胞相关因素外，迁移还受到细胞外基质 （ECM） 组成和密度的影响。ECM 由密集的蛋白质网络组成，包括胶原蛋白和蛋白聚糖，它们为 T 细胞上的粘附整合素受体提供支架。整合素是一个多样化的跨膜蛋白家族，每个跨膜蛋白都具有高度特化的结合域和下游信号转导效应。整合素受体在 T 细胞表面的动态表达使其能够快速适应其不断变化的环境³.重要的是，整合素将 ECM 和细胞内细胞骨架肌动蛋白网络连接起来，它们共同产生 T 细胞运动所需的推进力。

总之，迁移模式根据免疫细胞表型或环境信号而变化。这些复杂的生物过程受到 T 细胞、周围细胞和局部感染组织表面细胞因子、趋化因子和整合素表达的严格调控。 在体内，这些迁移机制可能很复杂，并且可能由几个加性信号⁴ 产生。由于这种复杂性，不可能在看似环环相扣的变量之间建立因果关系。为了克服这个问题，有几种 体外 方法来研究 T 细胞迁移的特定方面，例如对特定趋化因子信号的反应以及 T 细胞整合素与 ECM 结合蛋白之间的相互作用。该协议解决了分离和激活小鼠 CD8+ T 细胞的方法，包括二维空间中的 体外 迁移测定和用于分析指定 T 细胞迁移的计算分析工具。这些方法对用户是有利的，因为它们不需要复杂的材料或设备，就像文献中描述的其他一些细胞迁移测定一样。使用这些方法生成的细胞迁移数据可以以简单的方式提供免疫反应的证据，从而可以在 体内进行进一步的、明智的研究。

研究方案

动物协议得到了罗切斯特大学动物资源委员会的批准。本研究中的小鼠保持在罗切斯特大学动物设施的无病原体空间中。本研究使用雄性/雌性 C57BL/6 小鼠，年龄为 6-12 周 （15-30 g）。小鼠组织分离可以在工作台上进行，手套覆盖双手，面罩覆盖鼻子和嘴巴，或在生物安全柜内进行。所有细胞培养和板制备必须在生物安全柜中进行。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. CD8⁺ T细胞纯化和活化

1. 材料准备
   1. 对于CD8 ⁺ T细胞的阴性选择:从杂交瘤细胞系GK1.5和M5/114抗体的上清液中制备阴性选择培养基，它们分别产生抗CD4和抗MHCII。以1:1的比例混合上清液，过滤，并将其储存在4°C以备将来使用（>0.5μg每种抗体/百万总细胞）。或者，也可提供商业 CD8⁺ T 细胞分离试剂盒。
   2. 对于T细胞的活化:将500μL的CD3（10μg/ mL）和CD28（16μg/ mL）抗体在1x DPBS（不含钙和镁）中添加到非组织培养（TC）处理的24孔板中，并在4°C下储存过夜以确保板结合。
      注:抗体和蛋白质比常规 TC 处理的培养板/培养皿更好地包被在未经 TC 处理的培养板/培养皿上，因此未经 TC 处理的培养板用于 T 细胞生成。
2. 通过将 70 μm 细胞过滤器放入培养皿中来制备 10 cm 培养皿（或等效物），并将 2 mL R9 培养基分配到过滤器中（R9 培养基:RPMI 1640x 补充有 10% FBS、1% 抗生素 - 抗真菌剂、20 mM HEPES 缓冲液、1% MEM 非必需氨基酸、50 μM β-巯基乙醇）。
3. 获得由实验设计确定的具有适当遗传背景、性别、年龄和体重的小鼠。
4. 使用 CO₂ 对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位，或根据当地动物护理和使用协议定义并经该机构批准的适当安乐死策略。
5. 将鼠标置于仰卧姿势，将所有四个肢体垂直于身体伸展，并使用鼠标解剖 T 销或等效物将脚垫固定在解剖板上。用小鼠外科手术解剖剪刀在腹侧下腹部的皮肤层做一个浅表的中央切口，并直接切到下巴（~8 cm）。将皮肤与腹膜内膜分开，露出淋巴结。将皮肤垂直拉伸到远离躯干的地方，然后将其固定⁵.
   1. 使用钝钳（或标准小鼠手术解剖套件中的首选类型）轻轻切除颈部、轴向、臂部和腹股沟淋巴结。转移到步骤 1.2 中准备好的细胞过滤器中。
   2. 打开腹膜，切除脾脏。转移到步骤 1.2 中准备好的细胞过滤器中。
   3. 将小鼠尸体丢弃在适当的生物危害容器中。
6. 通过在70μm细胞过滤器上用步骤1.2的2mL R9培养基机械破碎来制备次级淋巴组织的单细胞悬浮液，方法是将组织破碎工具顺时针和逆时针旋转半圈。
   注意:鲁尔锁注射器的柱塞端，3 mL 或 10 mL，可以很好地粉碎和均质化组织。用户可以自行决定使用替代材料。
7. 用 7 mL 培养基清洗细胞、注射器端、过滤器和培养皿，确保过滤器保持直立，以防止可能存在的较大组织块或细胞聚集体转移到单细胞悬液中。
8. 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
9. 在室温（20°C）下以270× g沉淀细胞5分钟，并倒出上清液。
10. 加入 500 μL 裂解缓冲液 1 分钟以去除红细胞。用 9.5 mL R9 培养基稀释，并以 270 x g （20 °C） 离心 5 分钟。倒出上清液。
11. 将沉淀重悬于10mL先前制备的含有抗MHCII和抗CD4的阴性选择培养基中（步骤1.1.1）。在室温（20°C）下岩石30分钟。
12. 将细胞以 270 x g 沉淀 5 分钟并倒出上清液。用 10 mL R9 培养基洗涤 3 次。
13. 同时，在 15 mL 锥形管中，在 7 mL 培养基中洗涤 200 μL 绵羊抗大鼠 IgG 珠。将管子放在磁铁上，取出介质，然后重复洗涤步骤两次。将珠子重悬于 7 mL R9 培养基中。
14. 将细胞在270× g（20°C）下沉淀5分钟，倒出上清液，然后将沉淀重悬于步骤1.13的7mL珠状悬浮液中。在室温（20°C）下岩石45分钟。
15. 通过磁珠耗尽富集 CD8⁺ T 细胞。将锥形管直接放在磁铁上，不带盖 3 分钟，以去除抗体/珠子结合的细胞。应保留 CD8⁺ 细胞。将试管留在磁铁中，使用血清移液管或等效物收集细胞悬液，并将其转移到新的 15 mL 试管中。以270× g（20°C）离心5分钟，并在培养基中洗涤3次。
16. 用1x DPBS清洗预涂层活化板（步骤1.1.2）两次，而不直接在板的底面移液。
17. 可选:执行活/死淋巴细胞分离以去除死细胞。
    1. 将细胞转移到 15 mL 锥形管中。轻轻地将 2 mL 淋巴细胞分离培养基加入细胞悬液的底部。在低加速和减速下以900× g 离心10分钟（在室温下）。
       注意:活细胞将在培养基和分离培养基的界面（中间白色层）处分离。死细胞会在试管底部沉淀，最后可能会被丢弃。
    2. 将含有活淋巴细胞的中间层转移到新管中，并在室温下以270× g 离心5分钟。倒出上清液。
18. 将沉淀重悬于含有 10 U/mL 重组小鼠 IL-2 的 12 mL 培养基中。在未经 TC 处理的 24 孔板中每孔板 1 mL，并转移至 37 °C 过夜。

2. 提升活化的 CD8⁺ T 细胞

1. 使用标准台式光学显微镜，使用 4 倍或 10 倍物镜观察细胞。
   注意:与灭活的 T 细胞相比，活化的 T 细胞看起来更大、更圆或更细长，并且在整个孔中应该有密集的细胞簇。
2. 要取出活化细胞，请用 1 mL 移液管搅碎细胞，确保在板边缘充分混合。将细胞转移到新的 15 mL 锥形管中。
   注意:活化的细胞更粘，需要更剧烈的移液。
3. 用 1 mL R9 培养基洗涤孔以去除任何残留的细胞。如果需要，请重复一次。将细胞以270× g （20°C）离心5分钟。丢弃上清液。
4. 执行活/死淋巴细胞分离以去除死细胞，如步骤1.17-1.18所示。
5. 在非 TC 6 孔板中，在含有 IL-2 的 R9 培养基中每 3-4 天通过活/死细胞去除来维持 T 细胞。
   注意:在早期激活期间，T 细胞在小尺寸孔中增殖得更好，可能是由于 T 细胞-T 细胞接触或 T 细胞衍生的可溶因子有助于它们的激活。快速 T 细胞增殖导致培养基在培养后 24-48 小时内变黄。此时，提起细胞并将其转移到具有足够新鲜培养基（通常为每孔 5 mL）的较大孔（未包被、非 TC 6 孔板）中以补料细胞。每当培养基出现黄色颜色变化时，或每 3-4 天更换一次新鲜培养基。

3.玻璃皿的准备

1. 通过在4°C下用300μL /^{cm 2} 蛋白A（0.1mg / mL）包被过夜来制备玻璃细胞迁移室或板，通过分配到培养皿上并用1x DPBS洗涤两次并倾析，然后再进入下一步。
2. 用300μL /^{cm 2} 重组小鼠ICAM-1或VCAM-1 Fc嵌合体（0.1-2.75mg / mL）与重组小鼠趋化因子（0.1-10μg/ mL）一起包被迁移室或板2-3小时在室温下。将其他整合素配体如纤连蛋白，小鼠胶原IV和小鼠E-钙粘蛋白制备，以在4°C下以2.5-10μg/ mL直接包被腔室过夜。
   1. 用 1x DPBS 洗涤室两次，方法是分配到培养皿上并在加入细胞之前立即倾析。
      注:根据激活、分化、致敏和启动的状态，T 细胞在不同浓度的整合素配体和趋化因子中可以以不同的方式迁移。强烈建议在多种不同浓度下测定细胞迁移。
3. 如果将T细胞与其他细胞（如癌细胞）共培养，则在成像开始前24小时将贴壁细胞铺在玻璃涂层板上，以实时方式测量T细胞对癌细胞的杀伤。

4. 细胞的制备

1. 可选:在37°C下，用每1 x 10⁷ 个细胞1μg/ mL的细胞追踪染料在1x DPBS中对T细胞和贴壁细胞进行染色15分钟，或根据制造商的方案。
2. 使用血细胞计数器或等效物对细胞进行计数。
3. 在37°C室中将1 x 10⁵ 个CD8 ⁺ T细胞（或所需量）铺在补充有1-5g / L葡萄糖的Leibovitz's L-15培养基中。
   注:L-15 培养基配制为不含 CO₂-碳酸氢钠系统。它使用游离碱性氨基酸、磷酸盐缓冲液和半乳糖进行缓冲，以维持 pH 值。
4. 可选:执行整合素阻断。
   1. 用针对整合素的阻断抗体（1-10μg/ mL，抗小鼠CD11a（M17 / 4），抗小鼠CD18（M18 / 2），抗小鼠VLA-4（9C10）预孵育T细胞10分钟，并允许在同一抗体存在下爬行。

5. 延时显微镜

1. 进行视频显微镜检查。
2. 对于 T 细胞，每 10-60 秒采集一次明场和荧光图像，持续 10-60 分钟，或所需的采集设置。
   注:T细胞迁移对温度敏感，小鼠T细胞迁移的最佳温度为37°C。 该协议使用的温度控制系统由一个封闭和绝缘的显微镜甲板和一个附带的加热系统组成。成像室位于成像台上。该腔室的周边有一个装满蒸馏水的井，在成像过程中允许一致的热量和湿度。微孔位于成像室的中心。

6. 软件辅助分析T细胞迁移

1. 使用Volocity软件评估T细胞迁移。
   1. 打开 Volocity 并创建一个 新的图像序列。
   2. 选择 所有延时视频显微镜视频并将其 移动到 Volocity的蓝色区域。
   3. 使用对比度增强工具根据研究人员所需的设置调整亮度和对比度。
   4. 检查图像尺寸:20 倍为 0.325 μm，10 倍为 0.65 μm。
   5. 序列:设置时间点（例如:如果每 15 秒拍摄一张图像，持续 20 分钟，则为 81 张图像，每分钟 4 张）。
   6. 取消选中测量选项卡中的所有时间点。
   7. 使用强度找到对象 - 滑动条形图，使其刚好位于峰值。
   8. 按大小排除物体:直径小于 10 μm 且大于 100 μm 的所有细胞，以排除细胞碎片或非细胞颗粒。排除迁移时间少于记录时间 20% 的 T 细胞（这可能因每个研究者的定义而异）。
   9. 忽略静态对象 （复选框）。
   10. 自动连接断开的区域 （复选框）。
   11. 将最短路径设置为不超过 20 μm。
   12. 细胞迁移的轨迹是连接同一细胞位置随时间推移的线。确保跟踪算法通过检测每个帧中通过分割检测到单个对象的位置进行跟踪，并且对象在帧之间匹配。
   13. 通过选择"测量值">"保存协议">"命名新协议"来保存新协议。
   14. 单击"测量"选项卡中的"测量所有时间点"。
   15. 按时间跨度（从高到低）对轨道进行排序。
   16. 记录研究者定义的具有良好轨迹的所有单元格的轨迹 ID 号。在自动小区跟踪之后，需要对每个小区轨迹进行手动评估，以排除错误识别或损坏的轨迹。排除具有不良轨道的单元格。
   17. 将文件导出为逗号分隔的文本，并将数据传输到所需的分析软件。
       注: 基本参数:速度 （μm/min）、位移（净移动，μm）、轨迹长度（总路径长度，μm）和蜿蜒指数（MI; 净位移/轨迹长度。MI = 1 表示完全直线轨道）。
2. 使用图像 J 执行手动跟踪。
   1. 打开插件并选择 跟踪 和 手动跟踪。设置参数 - 时间间隔、x/y 校准（像素大小）和 z 校准（在手动跟踪模式下）。通过单击 "添加轨道"开始单个单元格跟踪，在第一个时间点选择一个单元格，然后在所有时间点继续进行。接下来，单击 "结束轨道"。对所有感兴趣的单元格重复此操作。
      注意:Trackmate 是另一个用于细胞跟踪的工具，是一种 通过 ImageJ 插件提供的自动跟踪软件。

结果

可以通过流式细胞术确认 T 细胞活化，寻找 CD69 和 CD44 的表达增加，它们是小鼠 T 细胞活化的典型标志物⁶。此外，可以通过流式细胞术测定 CD3⁺ CD8⁺ T 细胞的 T 细胞群的纯度。该方法产生 >90% CD8⁺ T 细胞群。

T细胞迁移可以通过软件辅助细胞追踪程序进行评估，这些程序既可重复又可调，以满足研究者的需求。用于确定实验效果的一些?...

讨论

理解体内收敛信号的生物学影响具有挑战性，而且不容易解释。本文介绍的方案提供了一种合理的方法来理解在高度定义和生物学相关条件下的 T 细胞迁移。这些条件可以根据研究者的判断来指定，并且可以修改方案以适应各种 T 细胞群、激活状态和细胞表型的需求。此外，许多配体和受体可以通过这些定义的抗体阻断 ^7,8 和配体包被玻璃程序

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software