原代小鼠 CD8+ T 细胞的实时体外迁移测定

摘要

该协议提供了一种在特定环境条件下进行原代小鼠T细胞分离的方法和T细胞迁移的延时显微镜检查，并进行了定量分析。

摘要

适应性免疫反应依赖于 T 细胞在血液、淋巴和组织中迁移以响应病原体和异物的能力。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要协调来自环境和局部免疫细胞的许多信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和粘附分子。此外，T 细胞运动受周围动态环境线索的影响，这些线索可以改变激活状态、转录景观、粘附分子表达等。 在体内，这些看似交织在一起的因素的复杂性使得很难区分有助于T细胞迁移的单个信号。该协议提供了从T细胞分离到计算机辅助分析的一系列方法，以在高度特定的环境条件下实时评估T细胞迁移。这些条件可能有助于阐明调节迁移的机制，提高我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制证据。更深入地了解影响细胞迁移的分子相互作用对于开发改进的治疗方法非常重要。

引言

T细胞是适应性抗原特异性免疫反应的主要效应因子。在群体水平上，T细胞是异质的，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。重要的是，CD8+ T 细胞是免疫系统的主要细胞溶解效应因子，可直接消除感染或功能失调的细胞¹。

成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴管循环以寻找抗原。在感染过程中，T 细胞在血液或组织中呈递抗原，并迅速流向脾脏或最近的引流淋巴结，开始产生有效的免疫反应。在任何一种情况下，T细胞都会被激活，进行克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液，如果还没有的话。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体下调，并上调许多对组织特异性迁移至关重要的整合素和趋化因子受体²。最终，T 细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号传导在内的收敛环境信号驱动的。

趋化因子大致可分为两大类：（1） 稳态信号，对分化、存活和基础功能至关重要，以及 （2） 炎症信号，如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，是趋化性所必需的。通常，趋化因子除了激活整合素表达外，还会产生驱动定向迁移的信号梯度，称为趋化性¹。趋化性受到精细调节且高度敏感，T细胞能够对梯度的微小变化做出反应，这些变化可以引导它们朝向特定方向或位置。

除了这些 T....

研究方案

动物协议得到了罗切斯特大学动物资源委员会的批准。本研究中的小鼠保持在罗切斯特大学动物设施的无病原体空间中。本研究使用雄性/雌性 C57BL/6 小鼠，年龄为 6-12 周 （15-30 g）。小鼠组织分离可以在工作台上进行，手套覆盖双手，面罩覆盖鼻子和嘴巴，或在生物安全柜内进行。所有细胞培养和板制备必须在生物安全柜中进行。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. CD8⁺ T细胞纯化和活化

1. 材料准备
   1. 对于CD8 ⁺ T细胞的阴性选择：从杂交瘤细胞系GK1.5和M5/114抗体的上清液中制备阴性选择培养基，它们分别产生抗CD4和抗MHCII。以1：1的比例混合上清液，过滤，并将其储存在4°C以备将来使用（>0.5μg每种抗体/百万总细胞）。或者，也可提供商业 CD8⁺ T 细胞分离试剂盒。
   2. 对于T细胞的活化：将500μL的CD3（10μg/ mL）和CD28（16μg/ mL）抗体在1x DPBS（不含钙和镁）中添加到非组织培养（TC）处理的24孔板中，并在4°C下储存过夜以确保板结合。
      注：抗体和蛋白质比常规 TC 处理的培养板/培养皿更好地包被在未经 TC 处理的培养板/培养皿上，因此未经 TC 处理的培养板用于 T 细胞生成。
2. 通....

讨论

理解体内收敛信号的生物学影响具有挑战性，而且不容易解释。本文介绍的方案提供了一种合理的方法来理解在高度定义和生物学相关条件下的 T 细胞迁移。这些条件可以根据研究者的判断来指定，并且可以修改方案以适应各种 T 细胞群、激活状态和细胞表型的需求。此外，许多配体和受体可以通过这些定义的抗体阻断 ^7,8 和配体包被玻璃程序

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software