マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

要約

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。

要約

適応免疫応答は、病原体や異物に応答して血液、リンパ液、組織を通過するT細胞の能力に依存しています。T細胞の遊走は、ケモカイン、ケモカイン受容体、接着分子など、環境や局所免疫細胞からの多くのシグナル入力の調整を必要とする複雑なプロセスです。さらに、T細胞の運動性は、周囲のダイナミックな環境手がかりの影響を受け、活性化状態、転写状況、接着分子の発現などを変化させる可能性があります。 In vivoでは、これらの一見絡み合った要因の複雑さが、T細胞の遊走に寄与する個々のシグナルを区別することを困難にしています。このプロトコルは、T細胞の単離からコンピュータ支援分析までの一連の方法を提供し、非常に特殊な環境条件下でのT細胞の遊走をリアルタイムで評価します。これらの条件は、移動を制御するメカニズムの解明に役立ち、T細胞動態の理解を深め、動物実験では達成が困難な強力なメカニズムの証拠を提供する可能性があります。細胞遊走に影響を与える分子間相互作用をより深く理解することは、より優れた治療法を開発するために重要です。

概要

T細胞は、適応的な抗原特異的免疫応答の主要なエフェクターです。集団レベルでは、T細胞は不均一であり、異なる特殊機能を持つ細胞サブセットで構成されています。重要なことに、CD8+ T細胞は免疫系の主要な細胞溶解エフェクターであり、感染した細胞や機能不全の細胞を直接排除します¹。

成熟したCD8+ T細胞は組織内に存在し、抗原を求めて血液やリンパ管を循環します。感染中、T細胞は血液または組織中に抗原を提示され、脾臓または最も近いドレナージリンパ節に迅速に排出されて、生産的な免疫応答を開始します。いずれの場合も、T細胞は活性化され、クローン性増殖を起こし、リンパ系を離れて血液に入ります(まだそこにない場合)。この過程で、細胞内シグナル伝達は、リンパホーミング受容体のダウンレギュレーションと、組織特異的な移動に不可欠な多数のインテグリンおよびケモカイン受容体のアップレギュレーションをもたらします²。最終的に、T細胞の感染部位への直接的な移動は、インテグリンとケモカインのシグナル伝達を含む環境シグナルの収束によって駆動されます。

ケモカインは、大きく分けて2つのクラスに分類できます:(1)分化、生存、および基礎機能に不可欠な恒常性シグナルと、(2)走化性に必要なCXCL9、CXCL10、CCL3などの炎症シグナル。一般に、ケモカインは、....

プロトコル

動物のプロトコルは、ロチェスター大学の動物資源に関する大学委員会によって承認されました。この研究のマウスは、ロチェスター大学の動物施設の病原体のない空間で飼育されました。本研究では、6-12週齢の雄/雌C57BL/6マウス(15-30g)を用いた。マウス組織の単離は、手を覆う手袋と鼻と口を覆うフェイスマスクを装着したベンチトップ、またはバイオセーフティキャビネット内で行うことができます。すべての細胞培養とプレート調製は、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. CD8⁺ T細胞の精製と活性化

1. 材料の準備
   1. CD8⁺ T細胞のネガティブセレクションの場合:抗CD4抗体と抗MHCII抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマ細胞株GK1.5およびM5/114抗体の上清からネガティブセレクション培地を調製します。上清を1:1の比率で混合し、ろ過し、将来の使用のために4°Cで保存します(各抗体>0.5μg/総細胞数100万個)。あるいは、市販のCD8⁺ T細胞単離キットも入手可能です。
   2. T細胞の活性化:500 μLのCD3(10 μg/mL)およびCD28(16 μg/mL)抗体を1x DPBS(カルシウムおよびマグネシウムなし)....

結果

T細胞の活性化の確認は、フローサイトメトリーによって達成でき、マウスT細胞における活性化の標準的なマーカーであるCD69およびCD44の発現増加を探します⁶。さらに、T細胞集団の純度は、CD3⁺ CD8⁺ T細胞のフローサイトメトリーによって決定できます。この方法では、>90%のCD8⁺ T細胞集団が得られます。

T細胞の遊走は、再現性が?.......

ディスカッション

in vivoでの収束シグナルの生物学的影響を理解することは困難であり、解釈は容易ではありません。本明細書に提示するプロトコルは、高度に定義された生物学的に関連性のある条件でのT細胞遊走を理解するための合理的な方法を提供する。これらの条件は、研究者の裁量に基づいて指定することができ、プロトコルは、さまざまなT細胞集団、活性化状態、および細胞表現型のニーズ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software