マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

要約

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。

要約

適応免疫応答は、病原体や異物に応答して血液、リンパ液、組織を通過するT細胞の能力に依存しています。T細胞の遊走は、ケモカイン、ケモカイン受容体、接着分子など、環境や局所免疫細胞からの多くのシグナル入力の調整を必要とする複雑なプロセスです。さらに、T細胞の運動性は、周囲のダイナミックな環境手がかりの影響を受け、活性化状態、転写状況、接着分子の発現などを変化させる可能性があります。 In vivoでは、これらの一見絡み合った要因の複雑さが、T細胞の遊走に寄与する個々のシグナルを区別することを困難にしています。このプロトコルは、T細胞の単離からコンピュータ支援分析までの一連の方法を提供し、非常に特殊な環境条件下でのT細胞の遊走をリアルタイムで評価します。これらの条件は、移動を制御するメカニズムの解明に役立ち、T細胞動態の理解を深め、動物実験では達成が困難な強力なメカニズムの証拠を提供する可能性があります。細胞遊走に影響を与える分子間相互作用をより深く理解することは、より優れた治療法を開発するために重要です。

概要

T細胞は、適応的な抗原特異的免疫応答の主要なエフェクターです。集団レベルでは、T細胞は不均一であり、異なる特殊機能を持つ細胞サブセットで構成されています。重要なことに、CD8+ T細胞は免疫系の主要な細胞溶解エフェクターであり、感染した細胞や機能不全の細胞を直接排除します¹。

成熟したCD8+ T細胞は組織内に存在し、抗原を求めて血液やリンパ管を循環します。感染中、T細胞は血液または組織中に抗原を提示され、脾臓または最も近いドレナージリンパ節に迅速に排出されて、生産的な免疫応答を開始します。いずれの場合も、T細胞は活性化され、クローン性増殖を起こし、リンパ系を離れて血液に入ります(まだそこにない場合)。この過程で、細胞内シグナル伝達は、リンパホーミング受容体のダウンレギュレーションと、組織特異的な移動に不可欠な多数のインテグリンおよびケモカイン受容体のアップレギュレーションをもたらします²。最終的に、T細胞の感染部位への直接的な移動は、インテグリンとケモカインのシグナル伝達を含む環境シグナルの収束によって駆動されます。

ケモカインは、大きく分けて2つのクラスに分類できます:(1)分化、生存、および基礎機能に不可欠な恒常性シグナルと、(2)走化性に必要なCXCL9、CXCL10、CCL3などの炎症シグナル。一般に、ケモカインは、インテグリン発現¹を活性化するだけでなく、走化性と呼ばれる方向性移動を促進するシグナル勾配を作り出します。走化性は細かく制御され、感度が高く、T細胞は特定の方向や場所に導く可能性のある勾配の小さな変化に応答することができます。

これらのT細胞関連因子に加えて、遊走は細胞外マトリックス(ECM)の組成と密度によっても影響を受けます。ECMは、コラーゲンやプロテオグリカンなどのタンパク質の密集したネットワークで構成されており、T細胞上の接着性インテグリン受容体の足場となっています。インテグリンは、膜貫通型タンパク質の多様なファミリーであり、それぞれが高度に特殊化された結合ドメインと下流のシグナル伝達効果を持っています。T細胞の表面にインテグリン受容体が動的に発現することで、T細胞の変化する環境に迅速に適応することができます³。重要なことは、インテグリンはECMと細胞内細胞骨格アクチンネットワークを結合し、これらが連携してT細胞の移動に必要な推進力を生成することです。

要約すると、遊走パターンは免疫細胞の表現型または環境シグナルによって異なります。これらの複雑な生物学的プロセスは、T細胞、周囲の細胞、および局所的な感染組織の表面上のサイトカイン、ケモカイン、インテグリンの発現によって厳密に制御されています。 インビボでは、これらの遊走メカニズムは複雑であり、いくつかの相加^{的なシグナル4}から生じる可能性がある。この複雑さにより、一見連動しているように見える変数間に因果関係を確立することは不可能な場合があります。これを克服するために、特定のケモカインシグナルに対する応答やT細胞インテグリンとECM結合タンパク質との間の相互作用など、T細胞遊走の特定の側面を研究するためのいくつかの in vitro アプローチがあります。このプロトコルは、2次元空間での in vitro 遊走アッセイと特定のT細胞遊走を分析するための計算解析ツールを使用して、マウスCD8+ T細胞を単離および活性化する方法に対応します。これらの方法は、文献に記載されている他のいくつかの細胞移動アッセイのように、高度な材料やデバイスを必要としないため、ユーザーにとって有利です。これらの方法で生成された細胞遊走データは、免疫応答の証拠を簡便な方法で提供できるため、in vivoでのさらなる情報に基づいた調査が可能になります。

プロトコル

動物のプロトコルは、ロチェスター大学の動物資源に関する大学委員会によって承認されました。この研究のマウスは、ロチェスター大学の動物施設の病原体のない空間で飼育されました。本研究では、6-12週齢の雄/雌C57BL/6マウス(15-30g)を用いた。マウス組織の単離は、手を覆う手袋と鼻と口を覆うフェイスマスクを装着したベンチトップ、またはバイオセーフティキャビネット内で行うことができます。すべての細胞培養とプレート調製は、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. CD8⁺ T細胞の精製と活性化

1. 材料の準備
   1. CD8⁺ T細胞のネガティブセレクションの場合:抗CD4抗体と抗MHCII抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマ細胞株GK1.5およびM5/114抗体の上清からネガティブセレクション培地を調製します。上清を1:1の比率で混合し、ろ過し、将来の使用のために4°Cで保存します(各抗体>0.5μg/総細胞数100万個)。あるいは、市販のCD8⁺ T細胞単離キットも入手可能です。
   2. T細胞の活性化:500 μLのCD3(10 μg/mL)およびCD28(16 μg/mL)抗体を1x DPBS(カルシウムおよびマグネシウムなし)に添加し、非組織培養(TC)処理した24ウェルプレートに添加し、プレートが結合することを確認します。
      注:抗体とタンパク質は、通常のTC処理されたものよりも非TC処理された培養プレート/ディッシュをよりよくコーティングするため、非TC処理された培養プレートはT細胞の生成に使用されます。
2. 70 μmの細胞ストレーナーをディッシュに入れて10 cmの培養ディッシュ(または同等品)を調製し、2 mLのR9培地をフィルター(R9培地:RPMI 1640xに10% FBS、1%抗生物質-抗真菌薬、20 mM HEPESバッファー、1% MEM非必須アミノ酸、50 μM β-メルカプトエタノール)を分注します。
3. 実験デザインによって決定された適切な遺伝的背景、性別、年齢、および体重を持つマウスを入手してください。
4. CO₂ を使用してマウスを安楽死させ、その後子宮頸部脱臼を行うか、地元の動物の世話と使用プロトコルによって定義され、施設によって承認された適切な安楽死戦略を使用します。
5. マウスを仰臥位に置き、4本の手足すべてを体に対して垂直に伸ばし、マウス解剖Tピンまたは同等のものを使用してフットパッドを解剖ボードに固定します。マウスの外科的解剖ハサミで腹側下腹部の皮膚層から表面的な中央切開を行い、あご(~8cm)までまっすぐに切り込みます。皮膚を腹膜の内壁から分離して、リンパ節を露出させます。皮膚を幹から垂直に伸ばし、固定します⁵。
   1. 鈍い鉗子(または標準的なマウス外科解剖キットの推奨タイプ)を使用して、頸椎、軸、上腕、および鼠径リンパ節を両側に穏やかに切除します。ステップ1.2で調製したセルストレーナに移します。
   2. 腹膜を開き、脾臓を取り出します。ステップ1.2で調製したセルストレーナに移します。
   3. マウスの死骸は適切なバイオハザードレセプタクルに廃棄します。
6. ステップ1.2から2mLのR9培地を含む70μmセルストレーナー上で機械的破壊することにより、組織破壊ツールを時計回りと反時計回りに繰り返し半回転させて、二次リンパ組織の単一細胞懸濁液を調製します。
   注:ルアーロックシリンジのプランジャーエンド(3 mLまたは10 mL)は、組織の粉砕と均質化に適しています。代替材料は、ユーザーの裁量で使用することができます。
7. 細胞、シリンジエンド、ストレーナー、および培養皿を7 mLの培地で洗浄し、ストレーナーが直立したままであることを確認して、単一細胞懸濁液に存在する可能性のある大きな組織片または細胞凝集体が移動するのを防ぎます。
8. 細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。
9. 細胞を室温(20°C)で270 x gで5分間ペレット化し、上清をデカントします。
10. 500 μLのライジングバッファーを1分間加えて、赤血球を除去します。9.5 mLのR9培地で希釈し、270 x g(20°C)で5分間遠心します。上清をデカントします。
11. ペレットを、抗MHCIIおよび抗CD4を含む、以前に調製したネガティブセレクション培地10mLに再懸濁します(ステップ1.1.1)。室温(20°C)で30分間岩を動かします。
12. 細胞を270 x g で5分間ペレット化し、上清をデカントします。R9培地10mLで3回洗浄します。
13. 同時に、15 mLのコニカルチューブで、200 μLのヒツジ抗ラットIgGビーズを7 mLの培地で洗浄します。チューブを磁石の上に置き、媒体を取り除き、洗浄手順を2回繰り返します。ビーズを7 mLのR9培地に再懸濁します。
14. 細胞を270 x g(20°C)で5分間ペレット化し、上清をデカントした後、ステップ1.13のビーズ懸濁液7 mLにペレットを再懸濁します。室温(20°C)で45分間岩を振る。
15. 磁気ビーズの枯渇によりCD8⁺ T細胞を濃縮します。コニカルチューブを蓋をせずに磁石に直接3分間置き、抗体/ビーズ結合細胞を除去します。CD8⁺ 細胞は保持する必要があります。チューブを磁石に入れたまま、血清学的ピペットまたは同等のものを使用して細胞懸濁液を回収し、新しい15 mLチューブに移します。270 x g(20°C)で5分間遠心分離し、培地で3回洗浄します。
16. プレコートされた活性化プレート(ステップ1.1.2)を1x DPBSで2回洗浄し、プレートの底面を直接ピペッティングせずに洗浄します。
17. オプション:生リンパ球/死リンパ球の分離を行い、死細胞を除去します。
    1. 細胞を15mLのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液の底に2 mLのリンパ球分離培地を穏やかに加えます。900 x g で10分間(室温)、低加減速で遠心分離します。
       注:生細胞は、培地と分離培地(中央の白色層)の界面で分離します。死んだ細胞はチューブの底でペレット状になり、最後に廃棄される場合があります。
    2. 生きたリンパ球を含む中間層を新しいチューブに移し、室温で5分間270 x g で遠心分離します。上清をデカントします。
18. ペレットを10 U/mL組換えマウスIL-2を含む12 mLの培地に再懸濁します。TC処理をしていない24ウェルプレートで1ウェルあたり1 mLをプレート化し、37°Cに一晩移します。

2. 活性化したCD8⁺ T細胞のリフティング

1. 標準的な卓上型光学顕微鏡で、4倍または10倍の対物レンズを使用して細胞を可視化します。
   注:活性化T細胞は、不活化T細胞と比較して大きく丸く、または細長く見え、ウェル全体に細胞の密集したクラスターを持つ必要があります。
2. 活性化細胞を持ち上げるには、1 mLピペットで細胞を破壊し、プレートの端でよく混合するようにします。細胞を新しい15 mLコニカルチューブに移します。
   注:活性化細胞はより粘着性があり、より激しいピペッティングが必要です。
3. ウェルを1 mLのR9培地で洗浄し、残っている細胞をすべて取り除きます。必要に応じて、もう一度繰り返します。細胞を270 x g (20°C)で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
4. ステップ1.17-1.18のように、生リンパ球/死リンパ球分離を行い、死細胞を除去します。
5. 非TC6ウェルプレートにIL-2を入れたR9培地で3〜4日ごとに生細胞/死細胞を除去してT細胞を維持します。
   注:T細胞は、おそらくT細胞とT細胞の接触またはそれらの活性化を助けるT細胞由来の可溶性因子のために、初期の活性化中に小さな寸法のウェルでよりよく増殖します。急速なT細胞の増殖により、培養後24〜48時間以内に培地が黄色になります。この時点で、細胞を持ち上げ、細胞に十分な新鮮培地(通常、ウェルあたり5 mL)を供給できる新鮮な培地(コーティングされていない非TCの6ウェルプレート)に移します。枯渇した培地は、黄色のミディアムカラーの変化が示されたとき、または3〜4日ごとに新鮮なものと交換してください。

3.ガラス皿の準備

1. ガラス細胞遊走チャンバーまたはプレートを300 μL/cm² Protein A(0.1 mg/mL)で4°Cで一晩コーティングし、1x DPBSで2回洗浄して皿に分注し、デカンテーションしてから次のステップに進みます。
2. 移行チャンバーまたはプレートに300 μL/cm² 組換えマウスICAM-1またはVCAM-1 Fcキメラ(0.1-2.75 mg/mL)を組換えマウスケモカイン(0.1-10 μg/mL)とともに室温で2-3時間コーティングします。フィブロネクチン、マウスコラーゲンIV、マウスE-カドヘリンなどの他のインテグリンリガンドは、チャンバーを2.5-10 μg/mLで一晩、4°Cで直接コーティングするようにレンダリングされます。
   1. チャンバーを1x DPBSで2回洗浄し、皿に分注し、細胞を追加する直前にデカントします。
      注:T細胞は、活性化、分化、感作、およびプライミングの状態に応じて、異なる濃度のインテグリンリガンドおよびケモカインで異なる方法で移動することができます。複数の異なる濃度での細胞移動を評価することが強く推奨されます。
3. T細胞をがん細胞などの他の細胞と共培養する場合は、イメージング開始の24時間前に接着細胞をガラスコーティングプレートに播種して、がん細胞のT細胞の死滅をリアルタイムで測定します。

4. 細胞の調製

1. オプション:T細胞および接着細胞を、1x DPBS中の1x DPBS中1 x 10⁷ 細胞あたり1 μg/mLで選択したセルトラッカー色素で、37°C、またはメーカーのプロトコールに従って染色します。
2. 血球計算盤または同等のものを使用して細胞をカウントします。
3. 37°Cチャンバーで1-5 g/Lグルコースを補充したLeibovitzのL-15培地に1 x 10⁵ CD8⁺ T細胞(または所望の量)をプレートします。
   注:L-15培地は、CO₂-重炭酸ナトリウムシステムなしで使用するために配合されています。遊離塩基性アミノ酸、リン酸緩衝液、およびガラクトースを使用して緩衝され、pHレベルを維持します。
4. オプション: インテグリン・ブロッキングを実行します。
   1. インテグリンに対するブロッキング抗体(1-10 μg/mL、抗マウスCD11a(M17/4)、抗マウスCD18(M18/2)、抗マウスVLA-4(9C10))でT細胞を10分間プレインキュベートし、同じ抗体の存在下でクロールします。

5. タイムラプス顕微鏡

1. ビデオ顕微鏡検査を行います。
2. T細胞については、明視野および蛍光画像を10〜60秒ごとに10〜60分間、または所望の取得設定で取得します。
   注:T細胞の遊走は温度に敏感であり、マウスT細胞の遊走に最適な温度は37°Cです。 このプロトコルが使用する温度制御システムは、密閉された断熱された顕微鏡デッキと付属の加熱システムで構成されています。イメージングチャンバーはイメージングデッキ上にあります。このチャンバーの周囲には蒸留水で満たされた井戸があり、イメージング中に一定の熱と湿度を確保します。マイクロウェルはイメージングチャンバーの中央に配置されています。

6. ソフトウェア支援によるT細胞遊走の解析

1. Volocityソフトウェアを使用して、T細胞の遊走を評価します。
   1. Volocityを開き、新しい画像シーケンスを作成します。
   2. すべてのタイムラプスビデオ顕微鏡ムービーを選択して、Volocityの青い領域に移動します。
   3. コントラスト強調ツールを使用して、研究者の希望の設定に明るさとコントラストを調整します。
   4. 画像サイズを確認してください:20倍の場合は0.325μm、10倍の場合は0.65μm。
   5. シーケンス:タイムポイントを設定します(例:15秒ごとに20分間画像を撮影する場合は81枚の画像、1分あたり4枚)。
   6. [測定]タブですべてのタイムポイントのチェックを外します。
   7. 強度を使用してオブジェクトを見つけます-バーをスライドさせて、ピークのちょうど右側にくるようにします。
   8. サイズでオブジェクトを除外する:直径10μm未満で100μmを超えるすべての細胞は、細胞の破片または非細胞粒子を除外します。記録時間の 20% 未満で遊走している T 細胞を除外します (これは、各研究者の定義によって異なります)。
   9. 静的オブジェクトを無視する (チェックボックス)。
   10. [分割されたトラクトを自動的に結合] (チェック ボックス)。
   11. 最短経路を20μm以下に設定します。
   12. セル移動のトラックは、同じセルの位置を経時的に結ぶ線です。各フレームのセグメンテーションによって個々のオブジェクトが検出された場所を検出し、フレーム間でオブジェクトが一致していることを確認して、トラッキング アルゴリズムがトラッキングしていることを確認します。
   13. 新しいプロトコルを保存するには 、[Measurements] > [Save Protocol] > [Name New Protocol] を選択します。
   14. 測定タブですべてのタイムポイントの測定をクリックします。
   15. トラックを高いものから低いものへとタイムスパンで並べ替えます。
   16. 調査員が定義した良好なトラックを持つすべてのセルのトラックID番号を記録します。自動セルトラッキングの後、誤って識別されたトラックや壊れたトラックを除外するために、各セルトラックを手動で評価する必要があります。不良トラックのセルを除外します。
   17. ファイルをカンマ区切りのテキストとしてエクスポートし、目的の分析ソフトウェアにデータを転送します。
       注:基本パラメータ:速度(μm / min)、変位(正味移動、μm)、トラック長(合計パス長、μm)、および蛇行指数(MI;正味変位/トラック長。MI = 1 は、完全に直線的な直線トラックを示します)。
2. Image J を使用して手動追跡を実行します。
   1. プラグインを開き、 トラッキング と 手動トラッキングを選択します。時間間隔、x/yキャリブレーション(ピクセルサイズ)、zキャリブレーション(手動トラッキングモード)などのパラメータを設定します。個々のセルの追跡を開始するには、[ トラックの追加] をクリックし、最初の時点で 1 つのセルを選択し、すべての時点までセルを続けます。次に、[ トラックの終了]をクリックします。対象のすべてのセルに対してこれを繰り返します。
      注:細胞追跡用の別のツールであるTrackmateは、ImageJプラグイン を介して 利用できる自動追跡ソフトウェアです。

結果

T細胞の活性化の確認は、フローサイトメトリーによって達成でき、マウスT細胞における活性化の標準的なマーカーであるCD69およびCD44の発現増加を探します⁶。さらに、T細胞集団の純度は、CD3⁺ CD8⁺ T細胞のフローサイトメトリーによって決定できます。この方法では、>90%のCD8⁺ T細胞集団が得られます。

T細胞の遊走は、再現性が?...

ディスカッション

in vivoでの収束シグナルの生物学的影響を理解することは困難であり、解釈は容易ではありません。本明細書に提示するプロトコルは、高度に定義された生物学的に関連性のある条件でのT細胞遊走を理解するための合理的な方法を提供する。これらの条件は、研究者の裁量に基づいて指定することができ、プロトコルは、さまざまなT細胞集団、活性化状態、および細胞表現型のニーズ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software