Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

Zusammenfassung

Die adaptive Immunantwort beruht auf der Fähigkeit einer T-Zelle, als Reaktion auf Krankheitserreger und Fremdkörper durch Blut, Lymphe und Gewebe zu wandern. Die T-Zell-Migration ist ein komplexer Prozess, der die Koordination vieler Signaleingänge aus der Umwelt und lokalen Immunzellen erfordert, einschließlich Chemokinen, Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Darüber hinaus wird die Motilität von T-Zellen durch dynamische Umgebungsreize beeinflusst, die den Aktivierungszustand, die Transkriptionslandschaft, die Expression von Adhäsionsmolekülen und vieles mehr verändern können. In vivo macht es die Komplexität dieser scheinbar miteinander verflochtenen Faktoren schwierig, einzelne Signale zu unterscheiden, die zur T-Zell-Migration beitragen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Methoden, von der T-Zellisolierung bis hin zur computergestützten Analyse, um die T-Zellmigration in Echtzeit unter hochspezifischen Umweltbedingungen zu bewerten. Diese Bedingungen können dazu beitragen, Mechanismen aufzuklären, die die Migration regulieren, unser Verständnis der T-Zell-Kinetik zu verbessern und starke mechanistische Beweise zu liefern, die durch Tierversuche nur schwer zu erlangen sind. Ein tieferes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, die sich auf die Zellmigration auswirken, ist wichtig, um verbesserte Therapeutika zu entwickeln.

Einleitung

T-Zellen sind die Haupteffektoren der adaptiven, antigenspezifischen Immunantwort. Auf Populationsebene sind T-Zellen heterogen und bestehen aus zellulären Untergruppen mit unterschiedlichen spezialisierten Funktionen. Wichtig ist, dass CD8+ T-Zellen die wichtigsten zytolytischen Effektoren des Immunsystems sind, die infizierte oder dysfunktionale Zellen direkt eliminieren¹.

Reife CD8+ T-Zellen befinden sich im Gewebe und zirkulieren auf der Suche nach Antigenen durch Blut und Lymphgefäße. Während der Infektion werden T-Zellen mit Antigenen im Blut oder Gewebe präsentiert und fließen schnell in die Milz oder den näch....

Protokoll

Die Tierprotokolle wurden vom University Committee on Animal Resources an der University of Rochester genehmigt. Die Mäuse in dieser Studie wurden im pathogenfreien Raum der Tiereinrichtung der University of Rochester gehalten. Für die vorliegende Studie wurden männliche/weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (15-30 g) verwendet. Die Isolierung des Gewebes von Mäusen kann auf einem Labortisch mit Handschuhen zum Bedecken der Hände und einer Gesichtsmaske zum Bedecken von Nase und Mund oder in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Zellkultur- und Plattenvorbereitungen müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Die in dieser S....

Diskussion

Das Verständnis der biologischen Auswirkungen konvergierender Signale in vivo ist eine Herausforderung und nicht einfach zu interpretieren. Die hierin vorgestellten Protokolle stellen eine vernünftige Methode dar, um die T-Zell-Migration unter hochdefinierten und biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen. Diese Bedingungen können nach Ermessen des Prüfarztes festgelegt werden, und die Protokolle können an die Bedürfnisse verschiedener T-Zellpopulationen, des Aktivierungsstatus und des Zellphänotyps a.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software