Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires

Résumé

Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.

Résumé

La réponse immunitaire adaptative dépend de la capacité d’un lymphocyte T à migrer dans le sang, la lymphe et les tissus en réponse aux agents pathogènes et aux corps étrangers. La migration des lymphocytes T est un processus complexe qui nécessite la coordination de nombreux signaux provenant de l’environnement et des cellules immunitaires locales, y compris les chimiokines, les récepteurs de chimiokines et les molécules d’adhésion. De plus, la motilité des lymphocytes T est influencée par les signaux environnementaux dynamiques environnants, qui peuvent modifier l’état d’activation, le paysage transcriptionnel, l’expression des molécules d’adhésion, etc. In vivo, la complexité de ces facteurs apparemment entrelacés rend difficile la distinction des signaux individuels qui contribuent à la migration des lymphocytes T. Ce protocole fournit une série de méthodes allant de l’isolement des lymphocytes T à l’analyse assistée par ordinateur pour évaluer la migration des lymphocytes T en temps réel dans des conditions environnementales très spécifiques. Ces conditions peuvent aider à élucider les mécanismes qui régulent la migration, améliorant ainsi notre compréhension de la cinétique des lymphocytes T et fournissant des preuves mécanistes solides qui sont difficiles à obtenir par des expériences sur des animaux. Une compréhension plus approfondie des interactions moléculaires qui ont un impact sur la migration cellulaire est importante pour développer des thérapies améliorées.

Introduction

Les lymphocytes T sont les principaux effecteurs de la réponse immunitaire adaptative spécifique à l’antigène. Au niveau de la population, les lymphocytes T sont hétérogènes, composés de sous-ensembles cellulaires avec des fonctions spécialisées distinctes. Il est important de noter que les lymphocytes T CD8+ sont les principaux effecteurs cytolytiques du système immunitaire, qui éliminent directement les cellules infectées ou dysfonctionnelles¹.

Les lymphocytes T CD8+ matures résident dans les tissus et circulent dans le sang et les lymphatiques à la recherche d’antigènes. Au cours de l’infection, les lymphocytes T ....

Protocole

Les protocoles pour les animaux ont été approuvés par le Comité universitaire sur les ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris de cette étude ont été maintenues dans l’espace exempt d’agents pathogènes de l’animalerie de l’Université de Rochester. Des souris C57BL/6 mâles/femelles, âgées de 6 à 12 semaines (15 à 30 g), ont été utilisées pour la présente étude. L’isolement des tissus de souris peut être effectué sur une paillasse avec des gants pour couvrir les mains et un masque facial pour couvrir le nez et la bouche, ou à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Toutes les cultures cellulaires et la préparation des plaques doivent être effectué....

Discussion

Comprendre l’impact biologique des signaux convergents in vivo est difficile et difficile à interpréter. Les protocoles présentés ici fournissent une méthode raisonnable pour comprendre la migration des lymphocytes T dans des conditions hautement définies et biologiquement pertinentes. Ces conditions peuvent être spécifiées à la discrétion de l’investigateur, et les protocoles peuvent être modifiés pour répondre aux besoins de diverses populations de lymphocytes T, à l’état d’activation e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software