Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.

Abstract

La risposta immunitaria adattativa dipende dalla capacità di una cellula T di migrare attraverso il sangue, la linfa e i tessuti in risposta a agenti patogeni e corpi estranei. La migrazione delle cellule T è un processo complesso che richiede il coordinamento di molti input di segnale provenienti dall'ambiente e dalle cellule immunitarie locali, tra cui chemochine, recettori per chemochine e molecole di adesione. Inoltre, la motilità delle cellule T è influenzata da segnali ambientali dinamici circostanti, che possono alterare lo stato di attivazione, il paesaggio trascrizionale, l'espressione delle molecole di adesione e altro ancora. In vivo, la complessità di questi fattori apparentemente intrecciati rende difficile distinguere i singoli segnali che contribuiscono alla migrazione delle cellule T. Questo protocollo fornisce una serie di metodi, dall'isolamento delle cellule T all'analisi assistita da computer, per valutare la migrazione delle cellule T in tempo reale in condizioni ambientali altamente specifiche. Queste condizioni possono aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la migrazione, migliorando la nostra comprensione della cinetica delle cellule T e fornendo forti prove meccanicistiche difficili da ottenere attraverso esperimenti sugli animali. Una comprensione più profonda delle interazioni molecolari che influenzano la migrazione cellulare è importante per sviluppare terapie migliorate.

Introduzione

Le cellule T sono i principali effettori della risposta immunitaria adattativa antigene-specifica. A livello di popolazione, le cellule T sono eterogenee, composte da sottogruppi cellulari con funzioni specializzate distinte. È importante sottolineare che le cellule T CD8+ sono i principali effettori citolitici del sistema immunitario, che eliminano direttamente le cellule infette o disfunzionali¹.

Le cellule T CD8+ mature risiedono nei tessuti e circolano nel sangue e nei linfatici alla ricerca di antigeni. Durante l'infezione, le cellule T vengono presentate con antigeni nel sangue o nei tessuti e drenano rapidamente nella milza o nel linfonodo drenante più vicino per iniziare una risposta immunitaria produttiva. In entrambi i casi, le cellule T si attivano, subiscono un'espansione clonale e lasciano il sistema linfatico per entrare nel sangue, se non già presente. Durante questo processo, la segnalazione intracellulare conferisce la sottoregolazione dei recettori di homing linfatico e la sovraregolazione di numerosi recettori delle integrine e delle chemochine essenziali per la migrazione tessuto-specifica². In definitiva, la migrazione diretta delle cellule T verso i siti di infezione è guidata da segnali ambientali convergenti che includono la segnalazione di integrine e chemochine.

Le chemochine possono essere classificate in due classi principali: (1) segnali omeostatici, che sono essenziali per la differenziazione, la sopravvivenza e la funzione basale, e (2) segnali infiammatori, come CXCL9, CXCL10 e CCL3, che sono necessari per la chemiotassi. Generalmente, le chemochine creano un gradiente di segnale che guida la migrazione direzionale, nota come chemiotassi, oltre ad attivare l'espressione dell'integrina¹. La chemiotassi è finemente regolata e altamente sensibile, con le cellule T in grado di rispondere a piccoli cambiamenti di gradiente che possono portarle verso una direzione o una posizione specifica.

Oltre a questi fattori correlati alle cellule T, la migrazione è influenzata anche dalla composizione e dalla densità della matrice extracellulare (ECM). La ECM è costituita da una fitta rete di proteine, tra cui collagene e proteoglicani, che forniscono l'impalcatura per i recettori delle integrine adesive sulle cellule T. Le integrine sono una famiglia diversificata di proteine transmembrana, ciascuna con domini di legame altamente specializzati ed effetti di segnalazione a valle. L'espressione dinamica dei recettori delle integrine sulla superficie di una cellula T consente un rapido adattamento ai loro ambienti mutevoli³. È importante sottolineare che le integrine collegano la MEC e le reti di actina citoscheletrica intracellulare che lavorano insieme per generare la forza propulsiva necessaria per il movimento delle cellule T.

In sintesi, i modelli di migrazione variano in base al fenotipo delle cellule immunitarie o ai segnali ambientali. Questi complessi processi biologici sono strettamente regolati dall'espressione di citochine, chemochine e integrine sulla superficie della cellula T, delle cellule circostanti e del tessuto locale infetto. In vivo, questi meccanismi migratori possono essere complessi e possono derivare da diversi segnali additivi⁴. A causa di questa complessità, può essere impossibile stabilire una relazione causale tra variabili apparentemente interconnesse. Per ovviare a ciò, esistono diversi approcci in vitro per studiare aspetti specifici della migrazione delle cellule T, come la risposta a specifici segnali di chemochine e l'interazione tra le integrine delle cellule T e le proteine leganti la ECM. Questo protocollo affronta metodi per isolare e attivare le cellule T CD8+ murine, con saggi di migrazione in vitro nello spazio bidimensionale e strumenti di analisi computazionale per l'analisi della migrazione delle cellule T specificate. Questi metodi sono vantaggiosi per l'utente perché non richiedono materiali o dispositivi sofisticati, come con alcuni altri saggi di migrazione cellulare descritti in letteratura. I dati sulla migrazione cellulare generati con questi metodi possono fornire prove di risposte immunitarie in modo semplicistico che consente ulteriori indagini informate in vivo.

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Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi in questo studio sono stati mantenuti nello spazio privo di agenti patogeni della struttura per animali dell'Università di Rochester. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi/femmine C57BL/6, di età compresa tra 6 e 12 settimane (15-30 g). L'isolamento del tessuto del topo può essere eseguito su un banco di lavoro con guanti per coprire le mani e una maschera facciale per coprire naso e bocca, o all'interno di una cabina di biosicurezza. Tutte le colture cellulari e la preparazione delle piastre devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Purificazione e attivazione delle cellule T CD8⁺

1. Preparazione dei materiali
   1. Per la selezione negativa delle cellule T CD8⁺ : preparare un terreno di selezione negativo dal surnatante delle linee cellulari di ibridoma GK1.5 e anticorpi M5/114, che producono rispettivamente anti-CD4 e anti-MHCII. Miscelare il surnatante in rapporto 1:1, filtrarlo e conservarlo a 4 °C per un uso futuro (>0,5 μg di ciascun anticorpo/milione di cellule totali). In alternativa, sono disponibili kit commerciali per l'isolamento delle cellule T CD8⁺ .
   2. Per l'attivazione delle cellule T: aggiungere 500 μL di anticorpi CD3 (10 μg/mL) e CD28 (16 μg/mL) in 1x DPBS (senza calcio e magnesio) a una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura non tissutale (TC) e conservare per una notte a 4 °C per garantire il legame della piastra.
      NOTA: Gli anticorpi e le proteine rivestono le piastre/piastre di coltura non trattate con TC meglio di quelle normali trattate con TC, quindi le piastre di coltura non trattate con TC vengono utilizzate per la generazione di cellule T.
2. Preparare una piastra di coltura da 10 cm (o equivalente) inserendo un colino cellulare da 70 μm nella piastra ed erogare 2 mL di terreno R9 nel filtro (terreno R9: RPMI 1640x integrato con il 10% di FBS, l'1% di antibiotico-antimicotico, 20 mM di tampone HEPES, l'1% di MEM di aminoacidi non essenziali, 50 μM di β-mercaptoetanolo).
3. Ottenere un topo con background genetico, sesso, età e peso appropriati come determinato dal disegno sperimentale.
4. Eutanasia del topo utilizzando CO₂ seguita da lussazione cervicale o strategie di eutanasia appropriate come definito dai protocolli locali di cura e utilizzo degli animali e approvati dall'istituto.
5. Posiziona il mouse in posizione supina, allunga tutti e quattro gli arti perpendicolarmente al corpo e fissa i piedini a una tavola di dissezione utilizzando i perni a T di dissezione del mouse o equivalenti. Praticare un'incisione superficiale centrale attraverso lo strato cutaneo sul basso ventre ventrale con le forbici da dissezione chirurgica del topo e tagliare fino al mento (~8 cm). Separare la pelle dal rivestimento peritoneale per esporre i linfonodi. Allungare la pelle perpendicolarmente lontano dal tronco e fissarla⁵.
   1. Asportare delicatamente i linfonodi cervicale, assiale, brachiale e inguinale bilateralmente utilizzando una pinza smussata (o il tipo preferito da un kit di dissezione chirurgica standard per topi). Trasferire nel colino preparato al punto 1.2.
   2. Aprire il peritoneo e rimuovere la milza. Trasferire nel colino preparato al punto 1.2.
   3. Smaltire la carcassa del topo nell'apposito contenitore per il rischio biologico.
6. Preparare una sospensione unicellulare dei tessuti linfoidi secondari mediante disgregazione meccanica sul filtro cellulare da 70 μm con 2 mL di terreno R9 dal passaggio 1.2 ruotando ripetutamente lo strumento di disgregazione tissutale di mezzo giro in senso orario e antiorario.
   NOTA: L'estremità dello stantuffo di una siringa luer-lock, da 3 ml o 10 ml, funziona bene per frantumare e omogeneizzare il tessuto. Materiali alternativi possono essere utilizzati a discrezione dell'utente.
7. Lavare le cellule, l'estremità della siringa, il colino e la piastra di coltura con 7 mL di terreno, assicurandosi che il filtro rimanga in posizione verticale per evitare il trasferimento di pezzi più grandi di tessuto o aggregati cellulari che potrebbero essere presenti nella sospensione a cellula singola.
8. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
9. Pellettare le celle a 270 x g a temperatura ambiente (20 °C) per 5 minuti e decantare il surnatante.
10. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi per 1 minuto per rimuovere i globuli rossi. Diluire con 9,5 mL di terreno R9 e centrifugare a 270 x g (20 °C) per 5 min. Decantare il surnatante.
11. Risospendere il pellet in 10 mL del terreno di selezione negativo precedentemente preparato contenente anti-MHCII e anti-CD4 (passaggio 1.1.1). Agitare a temperatura ambiente (20 °C) per 30 min.
12. Pellettare le celle a 270 x g per 5 minuti e decantare il surnatante. Lavare 3 volte con 10 ml di terreno R9.
13. Contemporaneamente, in una provetta conica da 15 mL, lavare 200 μL di perle di IgG anti-ratto di pecora in 7 mL di terreno. Posizionare il tubo su un magnete, rimuovere il mezzo e ripetere la fase di lavaggio due volte. Risospendere le perle in 7 mL di terreno R9.
14. Pellettare le celle a 270 x g (20 °C) per 5 minuti, decantare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 7 mL di sospensione a perle dal passaggio 1.13. Agitare a temperatura ambiente (20 °C) per 45 min.
15. Arricchire le cellule T CD8⁺ mediante deplezione delle biglie magnetiche. Posizionare il tubo conico direttamente sul magnete senza coperchio per 3 minuti per rimuovere le cellule legate all'anticorpo/perline. Le cellule CD8⁺ devono essere mantenute. Con la provetta ancora inserita nel magnete, raccogliere la sospensione cellulare utilizzando una pipetta sierologica o equivalente e trasferirla in una nuova provetta da 15 mL. Centrifugare a 270 x g (20 °C) per 5 minuti e lavare 3 volte in ambiente medio.
16. Lavare due volte la piastra di attivazione pre-rivestita (passaggio 1.1.2) con 1x DPBS senza pipettare direttamente sulla superficie inferiore della piastra.
17. Facoltativo: eseguire una separazione dei linfociti vivi/morti per rimuovere le cellule morte.
    1. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere delicatamente 2 mL di terreno di separazione linfocitaria sul fondo della sospensione cellulare. Centrifugare a 900 x g per 10 min (a temperatura ambiente) a bassa accelerazione e decelerazione.
       NOTA: Le cellule vive si separeranno all'interfaccia tra il terreno e il mezzo di separazione (strato bianco centrale). Le cellule morte si accumulano sul fondo del tubo e possono essere scartate alla fine.
    2. Trasferire lo strato intermedio contenente i linfociti vivi in una nuova provetta e centrifugare a 270 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante.
18. Risospendere il pellet in 12 mL di terreno con 10 U/mL di IL-2 ricombinante di topo. Piastra 1 mL per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti non trattata con TC e trasferimento a 37 °C durante la notte.

2. Sollevamento delle cellule T CD8⁺ attivate

1. Visualizzazione delle cellule con un microscopio ottico da banco standard, con obiettivo 4x o 10x.
   NOTA: Le cellule T attivate appariranno più grandi e rotonde o allungate rispetto alle cellule T inattivate e dovrebbero avere densi gruppi di cellule in tutto il pozzetto.
2. Per sollevare le cellule attivate, disgregare le cellule con una pipetta da 1 mL, assicurandosi di mescolare bene ai bordi della piastra. Trasferire le cellule in una nuova provetta conica da 15 mL.
   NOTA: Le cellule attivate sono più appiccicose e richiedono un pipettaggio più vigoroso.
3. Lavare i pozzetti con 1 mL di terreno R9 per rimuovere eventuali cellule rimanenti. Ripetere ancora una volta se necessario. Centrifugare le celle a 270 x g (20 °C) per 5 minuti. Scartare il surnatante.
4. Eseguire una separazione dei linfociti vivi/morti per rimuovere le cellule morte come nei passaggi 1.17-1.18.
5. Mantenere le cellule T mediante rimozione di cellule vive/morte ogni 3-4 giorni in terreno R9 con IL-2 in una piastra a 6 pozzetti non TC.
   NOTA: Le cellule T proliferano meglio in pozzetti di piccole dimensioni durante l'attivazione precoce, probabilmente a causa dei contatti cellula T-cellula T o di fattori solubili derivati dalle cellule T che ne aiutano l'attivazione. La rapida proliferazione delle cellule T provoca l'ingiallimento del terreno di coltura entro 24-48 ore dalla fase di coltura. A questo punto, sollevare le cellule e trasferirle in un pozzetto più grande (piastra a 6 pozzetti non rivestita, non TC) con terreno di coltura fresco sufficiente per alimentare le cellule (in genere 5 ml per pozzetto). Sostituire il terreno impoverito con quello fresco ogni volta che il giallo cambia colore o ogni 3-4 giorni.

3. Preparazione del piatto di vetro

1. Preparare le camere o le piastre di migrazione delle celle vetrose rivestendole con 300 μL/cm² di proteina A (0,1 mg/mL) per una notte a 4 °C, lavare due volte con 1x DPBS erogando sul piatto e travasando prima di passare alla fase successiva.
2. Rivestire la camera di migrazione o la piastra con 300 μL/cm² di chimera ricombinante ICAM-1 o VCAM-1 Fc di topo (0,1-2,75 mg/mL) insieme a una chemochina di topo ricombinante (0,1-10 μg/mL) per 2-3 ore a temperatura ambiente. Altri ligandi di integrine come la fibronectina, il collagene IV di topo e l'E-caderina di topo sono resi per rivestire direttamente la camera a 2,5-10 μg/mL durante la notte a 4 °C.
   1. Lavare le camere due volte con 1x DPBS erogando sulla piastra e decantando subito dopo prima di aggiungere le celle.
      NOTA: Le cellule T possono migrare in modo diverso in diverse concentrazioni di ligandi integrinici e chemochine a seconda dello stato di attivazione, differenziazione, sensibilizzazione e priming. Si consiglia vivamente di analizzare la migrazione cellulare in più concentrazioni diverse.
3. Piastra le cellule aderenti su piastre rivestite di vetro 24 ore prima dell'inizio dell'imaging se si co-coltivano cellule T con altre cellule, come le cellule tumorali, per misurare l'uccisione delle cellule T delle cellule tumorali in tempo reale.

4. Preparazione delle cellule

1. Opzionale: colorare le cellule T e le cellule aderenti con colorante tracker cellulare a scelta a 1 μg/mL per 1 x 10⁷ cellule in 1x DPBS per 15 minuti a 37 °C, o secondo il protocollo del produttore.
2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o equivalente.
3. Piastra 1 x 10⁵ cellule T CD8⁺ (o la quantità desiderata) nel terreno L-15 di Leibovitz integrato con 1-5 g/L di glucosio in una camera a 37 °C.
   NOTA: Il terreno L-15 è formulato per l'uso senza un sistema di bicarbonato di CO 2-sodio. Viene tamponato utilizzando aminoacidi basici liberi, tamponi fosfato e galattosio per mantenere i livelli di pH.
4. Opzionale: eseguire il blocco delle integrine.
   1. Preincubare le cellule T con un anticorpo bloccante contro un'integrina (1-10 μg/mL), anti-topo CD11a (M17/4), anti-topo CD18 (M18/2), anti-topo VLA-4 (9C10) per 10 minuti e lasciare strisciare in presenza dello stesso anticorpo.

5. Microscopia time-lapse

1. Eseguire la microscopia video.
2. Per le cellule T, acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti ogni 10-60 s per 10-60 minuti o con le impostazioni di acquisizione desiderate.
   NOTA: La migrazione delle cellule T è sensibile alla temperatura e la temperatura ottimale per la migrazione delle cellule T di topo è di 37 °C. Il sistema di controllo della temperatura utilizzato da questo protocollo è costituito da un ponte di microscopio chiuso e isolato con un sistema di riscaldamento collegato. La camera di imaging si trova sul ponte di imaging. Il perimetro di questa camera ha un pozzo riempito con acqua distillata che consente calore e umidità costanti durante l'imaging. Il micropozzetto è posizionato al centro della camera di imaging.

6. Analisi assistita da software della migrazione delle cellule T

1. Utilizza il software Volocity per valutare la migrazione delle cellule T.
   1. Apri Volocity e crea una nuova sequenza di immagini.
   2. Seleziona e sposta tutti i filmati di microscopia video time-lapse nell'area blu di Volocity.
   3. Regola la luminosità e il contrasto utilizzando lo strumento di miglioramento del contrasto in base alle impostazioni desiderate dal ricercatore.
   4. Controlla le dimensioni dell'immagine: 0,325 μm per 20x, 0,65 μm per 10x.
   5. Sequenza: imposta i punti temporali (es: 81 immagini se si scatta un'immagine ogni 15 s per 20 minuti, 4 al minuto).
   6. Deseleziona tutti i punti temporali nella scheda di misurazione.
   7. Trova gli oggetti usando l'intensità: fai scorrere la barra in modo che sia appena a destra del picco.
   8. Escludi oggetti in base alle dimensioni: tutte le celle di diametro inferiore a 10 μm e superiore a 100 μm per escludere detriti cellulari o particelle non cellulari. Escludere le cellule T che migrano per meno del 20% del tempo di registrazione (che può variare a seconda della definizione di ciascun ricercatore).
   9. Ignora oggetti statici (casella di controllo).
   10. Unisci automaticamente i tratti interrotti (casella di controllo).
   11. Impostare il percorso più breve su non più di 20 μm.
   12. La traccia di una migrazione cellulare è la linea che collega la posizione della stessa cella nel tempo. Assicurati che l'algoritmo di tracciamento stia tracciando rilevando dove i singoli oggetti vengono rilevati dalla segmentazione in ogni fotogramma e gli oggetti vengono abbinati tra i fotogrammi.
   13. Salva un nuovo protocollo scegliendo Misurazioni > Salva protocollo > Nome nuovo protocollo.
   14. Fare clic su Misura tutti i punti temporali nella scheda di misurazione.
   15. Ordina le tracce per intervallo di tempo, dal più alto al più basso.
   16. Registrare i numeri ID delle tracce per tutte le celle con tracce valide, come definito dall'investigatore. Dopo il tracciamento automatico delle celle, è necessaria la valutazione manuale di ciascuna traccia di celle per escludere tracce erroneamente identificate o interrotte. Escludi le celle con tracce non valide.
   17. Esporta il file come testo separato da virgole e trasferisci i dati al software di analisi desiderato.
       NOTA: Parametri di base: velocità (μm/min), spostamento (movimento netto, μm), lunghezza del binario (lunghezza totale del percorso, μm) e indice di curvatura (MI; spostamento netto/lunghezza del binario. MI = 1 indica un binario lineare completamente rettilineo).
2. Eseguite l'inseguimento manuale utilizzando l'immagine J.
   1. Apri i plug-in e seleziona il tracciamento e il tracciamento manuale. Impostare i parametri: intervalli di tempo, calibrazione x/y (dimensione dei pixel) e calibrazione z (in modalità di inseguimento manuale). Avvia il tracciamento delle singole celle facendo clic su aggiungi traccia, selezionando una cella al primo punto temporale e continuando attraverso tutti i punti temporali. Quindi, fai clic su Termina traccia. Ripeti l'operazione per tutte le celle di interesse.
      NOTA: Trackmate, un altro strumento per il tracciamento delle celle, è un software di tracciamento automatico disponibile tramite il plug-in ImageJ.

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Risultati

La conferma dell'attivazione delle cellule T può essere ottenuta mediante citometria a flusso, alla ricerca di un aumento dell'espressione di CD69 e CD44, che sono marcatori canonici di attivazione nelle cellule T murine⁶. Inoltre, la purezza della popolazione di cellule T può essere determinata mediante citometria a flusso per le cellule T CD3⁺ CD8⁺ . Questo metodo produce il >90 % della popolazione di cellule T CD8⁺ .

La migrazione d...

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Discussione

Comprendere l'impatto biologico dei segnali convergenti in vivo è impegnativo e non facile da interpretare. I protocolli qui presentati forniscono un metodo ragionevole per comprendere la migrazione delle cellule T in condizioni altamente definite e biologicamente rilevanti. Queste condizioni possono essere specificate a discrezione dello sperimentatore e i protocolli possono essere modificati per adattarsi alle esigenze delle varie popolazioni di cellule T, allo stato di attivazione e al fenotipo cellulare. In...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software