בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

Abstract

התגובה החיסונית הנרכשת מסתמכת על יכולתו של תא T לנדוד דרך דם, לימפה ורקמות בתגובה לפתוגנים ולגופים זרים. נדידת תאי T היא תהליך מורכב הדורש תיאום של קלטי אותות רבים מהסביבה ומתאי מערכת החיסון המקומית, כולל כימוקינים, קולטני כימוקין ומולקולות הידבקות. יתר על כן, תנועתיות תאי T מושפעת מרמזים סביבתיים דינמיים, שיכולים לשנות את מצב ההפעלה, נוף השעתוק, ביטוי מולקולות ההיצמדות ועוד. In vivo, המורכבות של גורמים אלה השלובים לכאורה זה בזה מקשה להבחין באותות בודדים התורמים לנדידת תאי T. פרוטוקול זה מספק שורה של שיטות מבידוד תאי T ועד ניתוח בעזרת מחשב כדי להעריך נדידת תאי T בזמן אמת בתנאים סביבתיים ספציפיים ביותר. תנאים אלה עשויים לעזור להבהיר מנגנונים המווסתים את הנדידה, לשפר את הבנתנו את הקינטיקה של תאי T ולספק ראיות מכניסטיות חזקות שקשה להשיג באמצעות ניסויים בבעלי חיים. הבנה עמוקה יותר של האינטראקציות המולקולריות המשפיעות על נדידת תאים חשובה לפיתוח טיפולים משופרים.

Introduction

תאי T הם הגורמים העיקריים לתגובה חיסונית נרכשת, ספציפית לאנטיגן. ברמת האוכלוסייה, תאי T הם הטרוגניים, המורכבים מתת-קבוצות תאיות בעלות פונקציות מיוחדות שונות. חשוב לציין, תאי CD8+ T הם המשפיעים הציטוליטיים העיקריים של המערכת החיסונית, אשר מבטלים ישירות תאים נגועים או לא מתפקדים¹.

תאי T בוגרים מסוג CD8+ שוכנים ברקמה וזורמים דרך הדם והלימפה בחיפוש אחר אנטיגנים. במהלך ההדבקה, תאי T מוצגים עם אנטיגנים בדם או ברקמה ומתנקזים במהירות לטחול או לבלוטת הלימפה המתנקזת הקרובה ביותר כדי להתחיל תגובה חיסונית פרודוקטיבית. בכל מקרה, תאי T מופעלים, עוברים הרחבה שבטית ועוזבים את מערכת הלימפה כדי להיכנס לדם, אם עדיין לא שם. במהלך תהליך זה, איתות תוך-תאי מעניק את הירידה בוויסות של קולטני הביות הלימפטיים ואת ה-upregulation של קולטני אינטגרין וכימוקין רבים החיוניים לנדידה ספציפית לרקמה². בסופו של דבר, ההגירה המכוונת של תאי T לאתרי זיהום מונעת על ידי אותות סביבתיים מתכנסים הכוללים איתות אינטגרין וכימוקין.

ניתן לסווג כימוקינים באופן כללי לשני סוגים עיקריים: (1) אותות הומיאוסטטים, החיוניים להתמיינות, הישרדות ותפקוד בסיסי, ו-(2) אותות דלקתיים, כגון CXCL9, CXCL10 ו-CCL3, הנדרשים לכימוטקסיס. באופן כללי, כימוקינים יוצרים שיפוע אות המניע נדידה כיוונית, המכונה כימוטקסיס, בנוסף להפעלת ביטוי אינטגרין¹. כימוטקסיס מווסתת היטב ורגישה מאוד, עם תאי T המסוגלים להגיב לשינויים זעירים בשיפוע שיכולים להוביל אותם לכיוון או מיקום מסוים.

בנוסף לגורמים אלה הקשורים לתאי T, ההגירה מושפעת גם מההרכב והצפיפות של המטריצה החוץ תאית (ECM). ה-ECM מורכב מרשת צפופה של חלבונים, כולל קולגן ופרוטאוגליקנים, המספקים את הפיגום לקולטני אינטגרין דביקים על תאי T. אינטגרינים הם משפחה מגוונת של חלבונים טרנסממברנליים, שלכל אחד מהם תחומי קישור מיוחדים מאוד והשפעות איתות במורד הזרם. ביטוי דינמי של קולטני אינטגרין על פני תא T מאפשר הסתגלות מהירה לסביבתם המשתנה³. חשוב לציין, אינטגרינים מחברים את רשתות האקטין ECM והאקטין הציטו-שלד התוך-תאי שפועלות יחד כדי ליצור את כוח ההנעה הדרוש לתנועת תאי T.

לסיכום, דפוסי ההגירה משתנים בהתאם לפנוטיפ של תא החיסון או לאותות סביבתיים. תהליכים ביולוגיים מורכבים אלה מווסתים היטב על ידי ביטוי של ציטוקינים, כימוקינים ואינטגרינים על פני השטח של תא T, התאים הסובבים אותו, והרקמה המקומית הנגועה. In vivo, מנגנוני נדידה אלה יכולים להיות מורכבים ועשויים לנבוע ממספר אותות מוספים⁴. בשל מורכבות זו, זה יכול להיות בלתי אפשרי לקבוע קשר סיבתי בין משתנים שלובים לכאורה. כדי להתגבר על כך, ישנן מספר גישות במבחנה לחקר היבטים ספציפיים של נדידת תאי T כגון תגובה לאותות כימוקינים ספציפיים והאינטראקציה בין אינטגרינים של תאי T וחלבונים קושרי ECM. פרוטוקול זה מטפל בשיטות לבידוד והפעלה של תאי T מסוג +CD8, עם מבחני נדידת מבחנה במרחב דו-ממדי וכלי ניתוח חישוביים לניתוח נדידת תאי T שצוינו. שיטות אלה מועילות למשתמש מכיוון שהן אינן דורשות חומרים או התקנים מתוחכמים, כמו בכמה מבחני נדידת תאים אחרים המתוארים בספרות. נתוני נדידת תאים הנוצרים בשיטות אלה יכולים לספק ראיות לתגובות חיסוניות באופן פשטני המאפשר חקירה נוספת ומושכלת in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. העכברים במחקר זה הוחזקו בחלל נטול הפתוגנים של מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברי C57BL/6 זכרים/נקבות, בגילאי 6-12 שבועות (15-30 גרם), שימשו במחקר הנוכחי. בידוד רקמות עכבר יכול להתבצע על ספסל עם כפפות לכיסוי ידיים ומסכת פנים לכיסוי האף והפה, או בתוך ארון בטיחות ביולוגית. כל תרבית התאים והכנת הצלחת חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור והפעלה של תאי CD8⁺ T

1. הכנת חומרים
   1. לברירה שלילית של תאי CD8⁺ T: הכינו מדיום ברירה שלילי מהסופרנאטנט של קווי תאי היברידיומה GK1.5 ונוגדנים M5/114, המייצרים נוגדנים נגד CD4 ואנטי MHCII, בהתאמה. מערבבים את הסופרנאטנט ביחס של 1:1, מסננים אותו ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי (>0.5 מיקרוגרם מכל נוגדן למיליון תאים בסך הכל). לחלופין, קיימות ערכות מסחריות לבידוד תאי CD8⁺ T.
   2. להפעלת תאי T: יש להוסיף 500 μL של נוגדני CD3 (10 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CD28 (16 מיקרוגרם/מ"ל) ב-1x DPBS (ללא סידן ומגנזיום) לתרבית שאינה רקמה (TC) שטופלה בצלחת 24 בארות ולאחסן למשך הלילה ב-4°C כדי להבטיח קשירת צלחת.
      הערה: נוגדנים וחלבונים מצפים צלחות/צלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC טוב יותר מאשר צלחות תרבית רגילות שטופלו ב-TC, כך שצלחות תרבית שאינן מטופלות ב-TC משמשות לייצור תאי T.
2. הכינו צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ (או שווה ערך) על ידי הכנסת מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך המנה והזריקו 2 מ"ל של מדיום R9 לתוך המסנן (מדיום R9: RPMI 1640x בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי, 20 mM HEPES buffer, 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול).
3. השג עכבר עם רקע גנטי מתאים, מין, גיל ומשקל כפי שנקבע על ידי תכנון הניסוי.
4. יש להרדים את העכבר באמצעות CO₂ ולאחר מכן לבצע פריקת צוואר הרחם, או אסטרטגיות המתת חסד מתאימות כפי שהוגדרו על ידי פרוטוקולים מקומיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי המוסד.
5. הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה, מתחו את כל ארבעת הגפיים בניצב לגוף והצמידו את כריות הרגליים ללוח דיסקציה באמצעות סיכות T לנתיחת עכבר, או שווה ערך. בצע חתך שטחי ומרכזי דרך השכבה העורית בבטן התחתונה הגחונית בעזרת מספריים כירורגיים של עכבר וחתך ישר עד הסנטר (~8 ס"מ). יש להפריד את העור מרירית הצפק כדי לחשוף את בלוטות הלימפה. מתחו את העור בניצב הרחק מתא המטען ונעצו אותו כלפי מטה⁵.
   1. יש לכרות בעדינות את בלוטות הלימפה הצוואריות, הציריות, הברכיאליות והמפשעות באופן דו-צדדי באמצעות מלקחיים קהים (או מהסוג המועדף מערכת דיסקציה כירורגית סטנדרטית של עכבר). העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.
   2. פתח את הצפק והסר את הטחול. העברה למסננת התא שהוכנה בשלב 1.2.
   3. יש להשליך את פגר העכבר בכלי הקיבול המתאים לסיכון ביולוגי.
6. הכינו תרחיף חד-תאי של רקמות הלימפה המשניות על ידי הפרעה מכנית מעל מסננת התאים של 70 מיקרומטר עם 2 מ"ל של מדיום R9 משלב 1.2 על ידי סיבוב כלי שיבוש הרקמות, חצי סיבוב בכיוון השעון ונגד כיוון השעון שוב ושוב.
   הערה: קצה הבוכנה של מזרק luer-lock, או 3 מ"ל או 10 מ"ל, עובד היטב כדי למחוץ הומוגניזציה של הרקמה. ניתן להשתמש בחומרים חלופיים לפי שיקול דעתו של המשתמש.
7. שטפו את התאים, קצה המזרק, המסננת וכלי התרבית עם 7 מ"ל של מדיום, וודאו שהמסננת נשארת זקופה כדי למנוע העברה של חתיכות גדולות יותר של רקמה או אגרגטים תאיים שעשויים להימצא בתרחיף החד-תאי.
8. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
9. משחררים את התאים ב 270 x גרם בטמפרטורת החדר (20 ° C) במשך 5 דקות ומרוקנים את supernatant.
10. הוסף 500 μL של חיץ שוכב למשך דקה אחת כדי להסיר תאי דם אדומים. לדלל עם 9.5 מ"ל של R9 בינוני ולהסתובב ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. דקנט את הסופר-נטנט.
11. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של מדיום הבחירה השלילית שהוכן בעבר המכיל אנטי MHCII ואנטי CD4 (שלב 1.1.1). רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
12. משחררים את התאים ב 270 x גרם במשך 5 דקות ומרוקנים את הסופרנטנט. יש לשטוף 3x עם 10 מ"ל של R9 בינוני.
13. במקביל, בצינור חרוטי של 15 מ"ל, לשטוף 200 μL של חרוזי IgG נגד חולדות כבשים ב 7 מ"ל של בינוני. הניחו את הצינור על מגנט, הסירו את המדיום וחזרו על שלב השטיפה פעמיים. להשעות את החרוזים ב 7 מ"ל של R9 בינוני.
14. גלולה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות, decant את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 7 מ"ל של השעיית חרוזים משלב 1.13. רוק בטמפרטורת החדר (20 מעלות צלזיוס) במשך 45 דקות.
15. העשרת תאי CD8⁺ T על ידי דלדול חרוזים מגנטי. הניחו את הצינורית החרוטית ישירות על המגנט ללא מכסה למשך 3 דקות כדי להסיר תאים הקשורים לנוגדנים/חרוזים. יש לשמור תאי CD8⁺ . כאשר הצינור עדיין בתוך המגנט, אספו את תרחיף התא באמצעות צינור סרולוגי או שווה ערך והעבירו אותו לצינור חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 270 x גרם (20°C) למשך 5 דקות וכביסה של 3 פעמים בטמפרטורה בינונית.
16. שטפו את צלחת ההפעלה המצופה מראש (שלב 1.1.2) עם DPBS אחד פעמיים מבלי לשפשף ישירות על המשטח התחתון של הצלחת.
17. אופציונלי: בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים.
    1. העברת תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף בעדינות 2 מ"ל של אמצעי הפרדת לימפוציטים לתחתית השעיית התא. צנטריפוגה במהירות 900 x גרם למשך 10 דקות (בטמפרטורת החדר) בתאוצה והאטה נמוכות.
       הערה: תאים חיים ייפרדו בממשק של מדיה בינונית ומדיה הפרדה (שכבה לבנה אמצעית). תאים מתים יכדורו בתחתית הצינור ועשויים להיות מושלכים בקצהו.
    2. מעבירים את השכבה האמצעית המכילה לימפוציטים חיים לצינור וצנטריפוגה חדשים במהירות 270 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקנט את הסופר-נטנט.
18. השהה מחדש את הגלולה ב 12 מ"ל של בינוני עם 10 U/mL עכבר רקומביננטי IL-2. צלחת 1 מ"ל לכל באר בצלחת שאינה TC מטופלת 24 בארות ולהעביר ל 37 ° C בן לילה.

2. הרמת תאי CD8⁺ T מופעלים

1. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, באמצעות המטרה 4x או 10x.
   הערה: תאי T פעילים ייראו גדולים יותר, עגולים או מוארכים בהשוואה לתאי T בלתי פעילים, וצריכים להיות להם אשכולות צפופים של תאים ברחבי הבאר.
2. כדי להרים את התאים המופעלים, לשבש את התאים עם פיפטה 1 מ"ל, הקפד לערבב היטב בשולי הצלחת. העברת תאים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
   הערה: תאים פעילים הם דביקים יותר ודורשים פיפטינג נמרץ יותר.
3. לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של מדיום R9 כדי להסיר את כל התאים שנותרו. חזור על הפעולה פעם נוספת במידת הצורך. צנטריפוגה את התאים ב 270 x גרם (20 ° C) במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
4. בצע הפרדת לימפוציטים חיים/מתים כדי להסיר תאים מתים כמו בשלבים 1.17-1.18.
5. שמור על תאי T על ידי הסרת תאים חיים/מתים כל 3-4 ימים בתווך R9 עם IL-2 בצלחת 6 בארות שאינה TC.
   הערה: תאי T מתרבים טוב יותר בבארות בעלות ממדים קטנים במהלך ההפעלה המוקדמת, אולי בשל מגעים בין תאי T לתאי T או גורמים מסיסים שמקורם בתאי T המסייעים להפעלתם. התפשטות מהירה של תאי T גורמת לתרבית להצהיב תוך 24-48 שעות לאחר התרבית. בשלב זה, הרימו את התאים והעבירו אותם לבאר גדולה יותר (צלחת לא מצופה, לא TC 6 בארות) עם מספיק תרבית טרייה כדי להזין את התאים (בדרך כלל 5 מ"ל לבאר). החלף מדיום מדולדל בטרי בכל פעם שמצוין בשינוי צבע בינוני צהוב, או כל 3-4 ימים.

3. הכנת צלחת זכוכית

1. הכינו תאי נדידת תאי זכוכית או צלחות על ידי ציפוי ב-300 מיקרוליטר/ס"מ² חלבון A (0.1 מ"ג/מ"ל) למשך הלילה ב-4°C, שטפו פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הכלי וניקוי לפני המעבר לשלב הבא.
2. צפו את תא הנדידה או הצלחת בכימרה של³⁰⁰ μL/cm 2 עכבר רקומביננטי ICAM-1 או VCAM-1 Fc כימרה (0.1-2.75 מ"ג/מ"ל) יחד עם כימוקין עכבר רקומביננטי (0.1-10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. ליגנדות אינטגרין אחרות כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן IV של עכבר ו-E-cadherin של עכבר ניתנות לציפוי ישיר של התא ב-2.5-10 מיקרוגרם/מ"ל למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   1. יש לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS אחד על ידי ניפוק על הצלחת וניקוי מיד לאחר מכן לפני הוספת תאים.
      הערה: תאי T יכולים לנדוד באופן שונה בריכוזים שונים של ליגנדות אינטגרין וכימוקינים בהתאם למצב ההפעלה, ההתמיינות, הרגישות והפריימינג. מומלץ מאוד לבצע נדידת תאים במספר ריכוזים שונים.
3. לוחית את התאים הדבקים על לוחות מצופים זכוכית 24 שעות לפני תחילת ההדמיה אם תרבית תאי T יחד עם תאים אחרים, כגון תאים סרטניים, כדי למדוד הרג תאי T של תאים סרטניים בזמן אמת.

4. הכנת תאים

1. אופציונלי: צביעת תאי T ותאים דבקים עם צבע מעקב תאים לבחירה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל לכל 1 x 10⁷ תאים ב 1x DPBS למשך 15 דקות ב 37 ° C, או על פי פרוטוקול היצרן.
2. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או שווה ערך.
3. צלחת 1 x 10⁵ CD8⁺ תאי T (או כמות רצויה) בתווך L-15 של לייבוביץ בתוספת 1-5 גרם / ליטר גלוקוז בתא 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: L-15 בינוני מיוצר לשימוש ללא מערכת CO_2-נתרן ביקרבונט. הוא נאגר באמצעות חומצות אמינו בסיסיות חופשיות, מאגרי פוספט וגלקטוז כדי לשמור על רמות pH.
4. אופציונלי: ביצוע חסימת אינטגרין.
   1. קדם-דגירה של תאי T עם נוגדן חוסם לאינטגרין (1-10 מיקרוגרם/מ"ל, CD11a נגד עכבר (M17/4), CD18 נגד עכבר (M18/2), VLA-4 נגד עכבר (9C10) למשך 10 דקות ולאפשר לזחול בנוכחות אותו נוגדן.

5. מיקרוסקופ קיטועי זמן

1. בצע מיקרוסקופ וידאו.
2. עבור תאי T, קבל תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי כל 10-60 שניות למשך 10-60 דקות, או הגדרות רכישה רצויות.
   הערה: נדידת תאי T רגישה לטמפרטורה, והטמפרטורה האופטימלית לנדידת תאי T של עכבר היא 37°C. מערכת בקרת הטמפרטורה בה משתמש פרוטוקול זה מורכבת מסיפון מיקרוסקופ סגור ומבודד עם מערכת חימום מחוברת. תא ההדמיה יושב על סיפון ההדמיה. היקף החדר הזה יש באר מלאה מים מזוקקים המאפשר חום ולחות עקביים במהלך ההדמיה. המיקרווול ממוקם במרכז תא ההדמיה.

6. ניתוח בעזרת תוכנה של נדידת תאי T

1. השתמש בתוכנת Volocity כדי להעריך נדידת תאי T.
   1. פתח את Volocity וצור רצף תמונות חדש.
   2. בחר והזז את כל סרטי מיקרוסקופ הווידאו עם קיטועי זמן לאזור הכחול בוולוסיטי.
   3. התאם את הבהירות והניגודיות באמצעות כלי שיפור הניגודיות להגדרות הרצויות של החוקר.
   4. בדוק גדלי תמונה: 0.325 מיקרומטר עבור 20x, 0.65 מיקרומטר עבור 10x.
   5. רצף: הגדר נקודות זמן (לדוגמה: 81 תמונות אם מצלמים תמונה כל 15 שניות למשך 20 דקות, 4 תמונות לדקה).
   6. בטל את הסימון של כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.
   7. מצא אובייקטים באמצעות עוצמה - החלק את הסרגל כך שיהיה בדיוק מימין לפסגה.
   8. אל תכלול עצמים לפי גודל: כל התאים שקוטרם קטן מ-10 מיקרומטר וגדול מ-100 מיקרומטר, כדי לא לכלול פסולת תאים או חלקיקים שאינם תאיים. אל תכלול תאי T שנודדים פחות מ- 20% מזמן ההקלטה (דבר שיכול להשתנות בהתאם להגדרה של כל חוקר).
   9. התעלם מאובייקטים סטטיים (תיבת סימון).
   10. צירוף אוטומטי של אסופות מנותקות (תיבת סימון).
   11. הגדר את הנתיב הקצר ביותר ללא יותר מ -20 מיקרומטר.
   12. המסלול של נדידת תאים הוא הקו המחבר את המיקום של אותו תא לאורך זמן. ודא שאלגוריתם המעקב עוקב על-ידי זיהוי היכן אובייקטים בודדים מזוהים לפי סגמנטציה בכל מסגרת, והאובייקטים מותאמים בין מסגרות.
   13. שמור פרוטוקול חדש על-ידי בחירה באפשרות מדידות > שמור פרוטוקול > תן שם לפרוטוקול חדש.
   14. לחץ על מדידת כל נקודות הזמן בכרטיסיה מדידה.
   15. מיין רצועות לפי טווח זמן, מגבוה לנמוך.
   16. רשום מספרי זיהוי של רצועות עבור כל התאים עם מסלולים טובים כפי שהוגדרו על-ידי החוקר. לאחר מעקב אוטומטי אחר תאים, יש צורך בהערכה ידנית של כל מסלול תא כדי לא לכלול מסלולים שזוהו באופן שגוי או שבורו. אל תכלול תאים עם רצועות פגומות.
   17. ייצא את הקובץ כטקסט מופרד באמצעות פסיקים והעבר נתונים לתוכנת הניתוח הרצויה.
       הערה: פרמטרים בסיסיים: מהירות (מיקרומטר לדקה), תזוזה (תנועה נטו, מיקרומטר), אורך מסלול (אורך נתיב כולל, מיקרומטר) ואינדקס מתפתל (MI; תזוזה נטו/אורך מסלול. MI = 1 מציין מסלול ליניארי ישר לחלוטין).
2. בצע מעקב ידני באמצעות תמונה J.
   1. פתח תוספים ובחר מעקב ומעקב ידני. הגדר את הפרמטרים - מרווחי זמן, כיול x/y (גודל פיקסל) וכיול z (במצב מעקב ידני). התחל מעקב אחר תאים בודדים על-ידי לחיצה על הוסף מסלול, בחירת תא אחד בנקודת הזמן הראשונה והמשכו לאורך כל נקודות הזמן. לאחר מכן, לחץ על סיום מסלול. חזור על כך עבור כל התאים המעניינים.
      הערה: Trackmate, כלי נוסף למעקב אחר תאים, הוא תוכנת מעקב אוטומטית הזמינה דרך תוסף ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אישור להפעלת תאי T יכול להיות מושג על ידי ציטומטריית זרימה, המחפשת ביטוי מוגבר של CD69 ו- CD44, שהם סמנים קנוניים של הפעלה בתאי T מורין⁶. בנוסף, ניתן לקבוע את טוהר אוכלוסיית תאי T על ידי ציטומטריית זרימה עבור תאי CD3⁺ CD8⁺ T. שיטה זו מניבה >90% אוכלוסיית תאי CD8⁺ T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הבנת ההשפעה הביולוגית של התכנסות אותות in vivo היא מאתגרת ולא קלה לפרשנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מספקים שיטה סבירה להבנת נדידת תאי T בתנאים מוגדרים מאוד ורלוונטיים ביולוגית. תנאים אלה יכולים להיות מוגדרים על פי שיקול דעתו של החוקר, וניתן לשנות את הפרוטוקולים כך שיתאימו לצרכים של אוכלו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software