Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол обеспечивает метод первичной изоляции Т-клеток мыши и покадровую микроскопию миграции Т-клеток в конкретных условиях окружающей среды с количественным анализом.
Адаптивный иммунный ответ зависит от способности Т-клеток мигрировать через кровь, лимфу и ткани в ответ на патогены и инородные тела. Миграция Т-клеток является сложным процессом, требующим координации многих сигналов, поступающих из окружающей среды и местных иммунных клеток, включая хемокины, хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии. Кроме того, на подвижность Т-клеток влияют динамические сигналы окружающей среды, которые могут изменить состояние активации, транскрипционный ландшафт, экспрессию молекул адгезии и многое другое. В естественных условиях сложность этих, казалось бы, взаимосвязанных факторов затрудняет различение отдельных сигналов, способствующих миграции Т-клеток. Этот протокол предоставляет ряд методов от выделения Т-клеток до компьютерного анализа для оценки миграции Т-клеток в режиме реального времени в высокоспецифических условиях окружающей среды. Эти условия могут помочь пролить свет на механизмы, регулирующие миграцию, улучшить наше понимание кинетики Т-клеток и предоставить убедительные механистические доказательства, которые трудно получить с помощью экспериментов на животных. Более глубокое понимание молекулярных взаимодействий, влияющих на миграцию клеток, важно для разработки улучшенных методов лечения.
Т-клетки являются основными эффекторами адаптивного, антиген-специфического иммунного ответа. На популяционном уровне Т-клетки неоднородны, состоят из клеточных субпопуляций с различными специализированными функциями. Важно отметить, что CD8+ Т-клетки являются основными цитолитическими эффекторами иммунной системы, которые непосредственно устраняют инфицированные или дисфункциональные клетки1.
Зрелые CD8+ Т-клетки находятся в тканях и циркулируют через кровь и лимфатические системы в поисках антигенов. Во время инфекции Т-клетки получают антигены в крови или тканях и быстро дренируются к селезенке или ближайшему дрен....
Протоколы содержания животных были одобрены Университетским комитетом по животным ресурсам Рочестерского университета. Мыши в этом исследовании содержались в свободном от патогенов помещении для животных Университета Рочестера. В настоящем исследовании использовались самцы/самки мышей C57BL/6 в возрасте 6-12 недель (15-30 г). Изоляция тканей мышей может быть выполнена на столе с перчатками, закрывающими руки, и лицевой маской, закрывающей нос и рот, или в шкафу биобезопасности. Вся клеточная культура и подготовка планшетов должны выполняться в шкафу биобезопасности. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов....
Подтверждение активации Т-клеток может быть получено с помощью проточной цитометрии с целью выявления повышенной экспрессии CD69 и CD44, которые являются каноническими маркерами активации в мышиных Т-клетках6. Кроме того, чистота популяции Т-клеток может быть определена с пом.......
Понимание биологического воздействия сходящихся сигналов in vivo является сложной и непростой задачей. Представленные здесь протоколы представляют собой разумный метод для понимания миграции Т-клеток в строго определенных и биологически значимых условиях. Эти условия могут быть о.......
Авторы заявляют, что все исследования и подготовка рукописи проводились в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Мы благодарим бывших и нынешних членов Лаборатории Кима, которые внесли свой вклад в разработку этих протоколов на протяжении долгого времени. Репрезентативные данные были получены с помощью P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Соединенные Штаты и P01 HL018208/HLBI NIH HHS/Соединенные Штаты. Эта публикация стала возможной отчасти благодаря гранту No T32 GM135134 от Институциональной премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
NIS elements | Nikon | Software | |
non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
Volocity | PerkinElmer | Software |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены