Анализ миграции in vitro в режиме реального времени на первичные мышиные CD8+ Т-клетки

Резюме

Этот протокол обеспечивает метод первичной изоляции Т-клеток мыши и покадровую микроскопию миграции Т-клеток в конкретных условиях окружающей среды с количественным анализом.

Аннотация

Адаптивный иммунный ответ зависит от способности Т-клеток мигрировать через кровь, лимфу и ткани в ответ на патогены и инородные тела. Миграция Т-клеток является сложным процессом, требующим координации многих сигналов, поступающих из окружающей среды и местных иммунных клеток, включая хемокины, хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии. Кроме того, на подвижность Т-клеток влияют динамические сигналы окружающей среды, которые могут изменить состояние активации, транскрипционный ландшафт, экспрессию молекул адгезии и многое другое. В естественных условиях сложность этих, казалось бы, взаимосвязанных факторов затрудняет различение отдельных сигналов, способствующих миграции Т-клеток. Этот протокол предоставляет ряд методов от выделения Т-клеток до компьютерного анализа для оценки миграции Т-клеток в режиме реального времени в высокоспецифических условиях окружающей среды. Эти условия могут помочь пролить свет на механизмы, регулирующие миграцию, улучшить наше понимание кинетики Т-клеток и предоставить убедительные механистические доказательства, которые трудно получить с помощью экспериментов на животных. Более глубокое понимание молекулярных взаимодействий, влияющих на миграцию клеток, важно для разработки улучшенных методов лечения.

Введение

Т-клетки являются основными эффекторами адаптивного, антиген-специфического иммунного ответа. На популяционном уровне Т-клетки неоднородны, состоят из клеточных субпопуляций с различными специализированными функциями. Важно отметить, что CD8+ Т-клетки являются основными цитолитическими эффекторами иммунной системы, которые непосредственно устраняют инфицированные или дисфункциональные клетки¹.

Зрелые CD8+ Т-клетки находятся в тканях и циркулируют через кровь и лимфатические системы в поисках антигенов. Во время инфекции Т-клетки получают антигены в крови или тканях и быстро дренируются к селезенке или ближайшему дрен....

протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Университетским комитетом по животным ресурсам Рочестерского университета. Мыши в этом исследовании содержались в свободном от патогенов помещении для животных Университета Рочестера. В настоящем исследовании использовались самцы/самки мышей C57BL/6 в возрасте 6-12 недель (15-30 г). Изоляция тканей мышей может быть выполнена на столе с перчатками, закрывающими руки, и лицевой маской, закрывающей нос и рот, или в шкафу биобезопасности. Вся клеточная культура и подготовка планшетов должны выполняться в шкафу биобезопасности. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов....

Результаты

Подтверждение активации Т-клеток может быть получено с помощью проточной цитометрии с целью выявления повышенной экспрессии CD69 и CD44, которые являются каноническими маркерами активации в мышиных Т-клетках⁶. Кроме того, чистота популяции Т-клеток может быть определена с пом.......

Обсуждение

Понимание биологического воздействия сходящихся сигналов in vivo является сложной и непростой задачей. Представленные здесь протоколы представляют собой разумный метод для понимания миграции Т-клеток в строго определенных и биологически значимых условиях. Эти условия могут быть о.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software