Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает метод первичной изоляции Т-клеток мыши и покадровую микроскопию миграции Т-клеток в конкретных условиях окружающей среды с количественным анализом.

Аннотация

Адаптивный иммунный ответ зависит от способности Т-клеток мигрировать через кровь, лимфу и ткани в ответ на патогены и инородные тела. Миграция Т-клеток является сложным процессом, требующим координации многих сигналов, поступающих из окружающей среды и местных иммунных клеток, включая хемокины, хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии. Кроме того, на подвижность Т-клеток влияют динамические сигналы окружающей среды, которые могут изменить состояние активации, транскрипционный ландшафт, экспрессию молекул адгезии и многое другое. В естественных условиях сложность этих, казалось бы, взаимосвязанных факторов затрудняет различение отдельных сигналов, способствующих миграции Т-клеток. Этот протокол предоставляет ряд методов от выделения Т-клеток до компьютерного анализа для оценки миграции Т-клеток в режиме реального времени в высокоспецифических условиях окружающей среды. Эти условия могут помочь пролить свет на механизмы, регулирующие миграцию, улучшить наше понимание кинетики Т-клеток и предоставить убедительные механистические доказательства, которые трудно получить с помощью экспериментов на животных. Более глубокое понимание молекулярных взаимодействий, влияющих на миграцию клеток, важно для разработки улучшенных методов лечения.

Введение

Т-клетки являются основными эффекторами адаптивного, антиген-специфического иммунного ответа. На популяционном уровне Т-клетки неоднородны, состоят из клеточных субпопуляций с различными специализированными функциями. Важно отметить, что CD8+ Т-клетки являются основными цитолитическими эффекторами иммунной системы, которые непосредственно устраняют инфицированные или дисфункциональные клетки1.

Зрелые CD8+ Т-клетки находятся в тканях и циркулируют через кровь и лимфатические системы в поисках антигенов. Во время инфекции Т-клетки получают антигены в крови или тканях и быстро дренируются к селезенке или ближайшему дрен....

протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Университетским комитетом по животным ресурсам Рочестерского университета. Мыши в этом исследовании содержались в свободном от патогенов помещении для животных Университета Рочестера. В настоящем исследовании использовались самцы/самки мышей C57BL/6 в возрасте 6-12 недель (15-30 г). Изоляция тканей мышей может быть выполнена на столе с перчатками, закрывающими руки, и лицевой маской, закрывающей нос и рот, или в шкафу биобезопасности. Вся клеточная культура и подготовка планшетов должны выполняться в шкафу биобезопасности. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов....

Результаты

Подтверждение активации Т-клеток может быть получено с помощью проточной цитометрии с целью выявления повышенной экспрессии CD69 и CD44, которые являются каноническими маркерами активации в мышиных Т-клетках6. Кроме того, чистота популяции Т-клеток может быть определена с пом.......

Обсуждение

Понимание биологического воздействия сходящихся сигналов in vivo является сложной и непростой задачей. Представленные здесь протоколы представляют собой разумный метод для понимания миграции Т-клеток в строго определенных и биологически значимых условиях. Эти условия могут быть о.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что все исследования и подготовка рукописи проводились в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим бывших и нынешних членов Лаборатории Кима, которые внесли свой вклад в разработку этих протоколов на протяжении долгого времени. Репрезентативные данные были получены с помощью P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Соединенные Штаты и P01 HL018208/HLBI NIH HHS/Соединенные Штаты. Эта публикация стала возможной отчасти благодаря гранту No T32 GM135134 от Институциональной премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm dishCorning353003or equivalent
15 mL conical tubeThermoFisher339650or equivalent
1x DPBSGibco14190144without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treatedCorning3736or equivalent
70 µm cell strainerFisherScientific352350or equivalent
ACK lysing bufferThermoFisherA1049201or equivalent
Allegra 6KR centrifugeThermoScientificsorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucketor equivalent
Beta mercaptoethanolSigmaM3148or equivalent
CellTrace VioletThermoFisherC34571Or equivalent
CentrifugeThermoScientificSorvall ST 16Ror equivalent
Collagen (IV)Corning354233or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clearBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dor equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kitStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLor equivalent
FibronectinSigmaAldrich10838039001or equivalent
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Filter cubesNikon or Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080or equivalent
HQ CCD cameraCoolSNAPor equivalent
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ automatic tracking plug inhttp://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ manual tracking plug inhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VariousSee MaterialsMedium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol redThermoFisher21083027
Luer Lok disposable syringeFisher Scientific14-955-459or equivalent
Lymphocyte separation mediumCorning25-072-CIor equivalent
M5/114ATCCTIB-120
MEM Non-Essential Amino AcidsThermoFisher11140050or equivalent
Microscope heating systemOkolabokolab.comCustom designs available
Millicell EZ slideMilliporeC86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kitBiolegend480043
Mouse E-cadherinR&D systems8875-EC-050or equivalent
Mouse surgical dissection kitFisher Scientific13-820-096or equivalent
NIS elementsNikonSoftware
non-TC 24wpCorning353047or equivalent
Penicillin-streptomycinThermoFisher15140122or equivalent
Protein AThermoFisher Scientificor equivalent
R9VariousSee MaterialsMedium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimeraR&D systems796-IC-050or equivalent
Recombinant Mouse IL2Biolegend575410or equivalent
RPMI 1640xThermoFisher11875093or equivalent
T pinsFisher ScientificS99385or equivalent
TE2000-U microscopeNikonor equivalent
Various recombinant mouse chemokineR&D systemsor equivalent
VCAM-1 Fc chimeraR&D systems643-VM-050or equivalent
VolocityPerkinElmerSoftware

Ссылки

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. <....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены