一种诱导小鼠脑裂症以模拟大血管介导的脑血管功能障碍的视觉方法

摘要

我们证明了化学诱导小鼠大血管扩张作为研究脑血管功能障碍的模型，可用于血管性痴呆和阿尔茨海默病建模。我们还演示了通过注射硅橡胶化合物来可视化脉管系统，并为测量血管大小的变化提供清晰的视觉指导。

摘要

血脑 （BBB） 是一个重要的系统，它调节与外围的选择性大脑循环，例如，允许必要的营养物质进入并从大脑中排出过多的氨基酸或毒素。 为了模拟 BBB 在血管性痴呆 （VaD） 或阿尔茨海默病 （AD） 等疾病中如何受损，研究人员开发了模拟血管扩张的新方法。在这些疾病状态下，受损的 BBB 可能是有害的，并导致 BBB 失调，从而导致影响大脑功能的不良和病理后果。我们能够修改一种现有技术，使我们能够直接注射到大脑池 （CM） 中，以使用弹性蛋白酶诱导血管扩张，并破坏 BBB 的紧密连接 （TJ）。使用这种方法，我们能够看到与以前技术相比的各种成功指标，包括一致的血管扩张、降低死亡率或提高恢复率，以及改进填充剂/遮光剂（一种硅橡胶化合物）用于标记血管以进行扩张分析的递送。这种改进的微创方法取得了可喜的结果，注射后 2 周至 3 个月小鼠大血管的持续扩张增加了 19%-32%。这种改善与以前的研究形成鲜明对比，以前的研究显示仅在 2 周标记时扩张增加。其他数据表明，即使在 9.5 个月后，该病仍持续扩张。通过比较弹性蛋白酶和载体注射组的血管直径来证实这种增加。总体而言，这项技术对于使用动物模型研究影响中枢神经系统 （CNS） 的病理疾病很有价值。

引言

排列在脑毛细血管上的微血管内皮细胞是形成血脑屏障 （BBB）¹ 的主要成分，该屏障在调节进出外周大脑循环的物质方面起着至关重要的作用。神经组织所需的必需营养素被允许进入 BBB，而一些必需氨基酸（如谷氨酸）被从大脑中排出，因为高浓度会对脑组织造成永久性的神经兴奋性损伤²。在正常生理条件下，BBB 限制了白蛋白 ^3,4 和凝血酶原等血浆蛋白的数量进入大脑，因为它们可能会产生有害影响 ^5,6,7。最后，BBB 保护大脑免受外周循环的神经毒素的侵害，例如食物或环境中的外源性物质¹。总体而言，对脑组织的损伤是不可逆的，与低水平神经发生⁸ 相关的衰老突出了 BBB 在保护和防止任何因素加速神经退行性过程方面的重要性。

在多脂扩张症（或大血管扩张）中，观察到血管弹性降低，这导致血管发生形态变化，从而使它们功能失调⁹ 并导致大脑中的血流减少。这种血流量的....

研究方案

本研究使用在生理水平上表达人淀粉样蛋白斑块的 App^NL-F小鼠 （3 个月大），尽管该系统可用于任何啮齿动物模型。所有动物程序均已获得 CAMH 动物护理委员会（协议 #843）的批准，并符合加拿大动物护理委员会指南的道德标准。小鼠在内部饲养并保持 12 小时的明暗循环， 随意 获取食物和水。

1. 大脑池 （CM） 注射程序

1. 手术
   1. 将小鼠（APP^NL-F，两性，3 个月）置于麻醉诱导室中 1 分钟。
      注：用 5% 异氟醚和 1% 氧气混合冲洗腔室至少 1 分钟。
   2. 麻醉小鼠后，将动物从腔室中取出，将其放在新的手术单上，并通过将鼻锥放在鼻子上来保持麻醉（异氟醚，2.5%-3%）。
      注意：通过捏住脚趾检查麻醉深度，以确保没有反射。
   3. 涂抹眼药膏以防止干燥。然后，皮下注射 0.1 mL 布比卡因（局部麻醉剂;1-2 mg/kg 0.125%，稀释比为 1：2）到切口部位和 Metacam（镇痛剂;5 mg/kg，稀释比为 1：10）。在进行手术前皮下注射 0.5 mL 生理盐水以保持动物水分，以补偿手术过程中任何潜在的失血。
   4. 为了获得清晰的切口部位，剃掉枕骨底部的颈部，用无菌 PBS 擦拭表面，然后将受试者转移到俯卧位的立体定位框架上。
      注意：确保通过立体定位鼻锥维持麻醉....

讨论

本文展示了一种改进的脑血管扩张方案，为将弹性蛋白酶注射到小鼠的大脑池中提供了一种精确而直接的方法。这个解剖点是通往脑脊液的直接门户，为研究不同的神经系统疾病提供了宝贵的途径。这种改良技术的主要优点之一是，将单剂量的弹性蛋白酶注射到小鼠的大脑池中能够引起并维持大血管扩张至少 3 个月，而无需重复注射或植入套管。将弹性蛋白酶施用到 AD 小鼠模型中的方法是另一个.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G catheter	University Medstore	2546-CABD305145	Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanol	University Medstore	https://www.uoftmedstore.com/index.sz	For removing the microfil
Betadine scrub	#	https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub	Sterilization
Betadine solution	Amazon	https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW	Sterilization
Bupivacaine	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Clippers	BrainTree Scientific Inc	CLP-41590	Shave fur
Cotton Q-tip	University Medstore	1962	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase	Sigma-aldrich	E7885	Used for the dilatation of blood vessel
Ethanol	University Medstore	39752-P016-EAAN	Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568	Invitrogen	A11004	For staining mature neurons
Graphpad prism 10	Graphpad prism 10	https://www.graphpad.com/	Statistical analysis software
Hamilton syringe	Sigma-aldrich	28614-U	Injection elastase
Heat pad	Amazon	https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ	Maintain body temperature
ImageJ software	Fiji Imagej software	imagej.net (USA)	Image analysis software
Induction chamber	Provided by animal facility	N/A	Anesthesia induction
Metacam	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Methyl salicylate	Sigma-aldrich	M6752	For removing the microfil
Microfil	Flow Tech, Carver, Massachusetts	https://www.flowtech-inc.com/order/	Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuN	Millipore Sigma	MAB377	For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.	Olympus Life Science	https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104	Imaging software
Paraformaldehyde	University Medstore	PAR070.1	For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pump	VWR International	https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps	Needed for perfusion
Scalpel	University Medstore	2580-M90-10	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxic	Provided by animal facility	N/A	So secure the animal for surgery
Surgical scissor	University Medstore	22751-A9-240	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tape	University Medstore	https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2	Secure the animal on the diaper
Sutures	University Medstore	2297-VS881	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezers	University Medstore	7731-A10-612	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)