Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

Resumen

Demostramos la inducción química de la dilatación de grandes vasos sanguíneos en ratones como modelo para investigar la disfunción cerebrovascular, que se puede utilizar para el modelado de la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer. También demostramos la visualización de la vasculatura mediante la inyección de compuesto de caucho de silicona y proporcionamos una guía visual clara para medir los cambios en el tamaño de los vasos sanguíneos.

Resumen

El hematoencefálico (BBB) es un sistema crucial que regula la circulación selectiva del cerebro con la periferia, por ejemplo, permitiendo la entrada de nutrientes necesarios y la expulsión de aminoácidos o toxinas excesivas del cerebro. Para modelar cómo la BHE puede verse comprometida en enfermedades como la demencia vascular (VAD) o la enfermedad de Alzheimer (EA), los investigadores desarrollaron métodos novedosos para modelar la dilatación de los vasos. Una BHE comprometida en estos estados de enfermedad puede ser perjudicial y dar lugar a la desregulación de la BHE, lo que conduce a consecuencias adversas y patológicas que afectan a la función cerebral. Pudimos modificar una técnica existente que nos permitía inyectar directamente en la Cisterna magna (CM) para inducir la dilatación de los vasos sanguíneos utilizando elastasa y romper las uniones estrechas (TJ) de la BBB. Con este método, pudimos ver varias métricas de éxito con respecto a las técnicas anteriores, incluida la dilatación constante de los vasos sanguíneos, la reducción de la mortalidad o la mejora de la recuperación, y la mejora del agente de relleno/opacificante, un compuesto de caucho de silicona, para el etiquetado de los vasos sanguíneos para el análisis de dilatación. Este método mínimamente invasivo modificado ha tenido resultados prometedores, con un aumento del 19% al 32% en la dilatación sostenida de los vasos sanguíneos grandes en ratones de 2 semanas a 3 meses después de la inyección. Esta mejora contrasta con estudios previos, que mostraron un aumento de la dilatación solo a las 2 semanas. Los datos adicionales sugieren una expansión sostenida incluso después de 9,5 meses. Este aumento se confirmó comparando el diámetro de los vasos sanguíneos de la elastasa y el grupo inyectado en el vehículo. En general, esta técnica es valiosa para estudiar los trastornos patológicos que afectan al sistema nervioso central (SNC) utilizando modelos animales.

Introducción

Las células endoteliales microvasculares que recubren los capilares cerebrales son los principales componentes para formar la barrera hematoencefálica (BBB)¹, que desempeña un papel crucial en la regulación de lo que entra o sale de la circulación cerebral con la periferia. Los nutrientes esenciales necesarios para el tejido nervioso pueden entrar en la BBB, mientras que algunos aminoácidos esenciales como el glutamato son expulsados del cerebro, ya que las altas concentraciones pueden causar un daño neuroexcitatorio permanente en^{el tejido cerebral}. En condiciones fisiológicas normales, la BHE limita la cantidad de prote....

Protocolo

Para este estudio se utilizaron ratones^{App NL-F}(3 meses de edad) que expresan placa amiloide humana a nivel fisiológico, aunque este sistema se puede utilizar con cualquier modelo de roedores. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de CAMH (Protocolo # 843) y estaban de acuerdo con los estándares éticos de las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Los ratones se criaron en casa y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con acceso ad libitum a comida y agua.

1. Procedimiento para la inyección de Cisterna magna (CM)

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Resultados

Logramos localizar la Cisterna magna debajo de la región occipital del cráneo después de colocar cuidadosamente al ratón en el marco estereotáxico y diseccionar los músculos. Esta estructura anatómica, que se asemeja a un triángulo invertido y está resaltada en amarillo, está situada debajo de la base del cráneo (Figura 1). Para garantizar la precisión y evitar cualquier daño al tejido cerebral, se insertaron suavemente 1-2 mm del bisel de la jeringa Hamilton en la Cisterna magn.......

Discusión

Este artículo demuestra un protocolo mejorado para la dilatación cerebrovascular, proporcionando un enfoque preciso y directo para la inyección de elastasa en la Cisterna magna de ratones. Este punto anatómico sirve como puerta de entrada directa al líquido cefalorraquídeo, ofreciendo una valiosa vía para la investigación de diferentes enfermedades neurológicas. Una de las principales ventajas de esta técnica modificada es que la inyección de una sola dosis de elastasa en la Cisterna magna de ratones fue capaz.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G catheter	University Medstore	2546-CABD305145	Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanol	University Medstore	https://www.uoftmedstore.com/index.sz	For removing the microfil
Betadine scrub	#	https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub	Sterilization
Betadine solution	Amazon	https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW	Sterilization
Bupivacaine	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Clippers	BrainTree Scientific Inc	CLP-41590	Shave fur
Cotton Q-tip	University Medstore	1962	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase	Sigma-aldrich	E7885	Used for the dilatation of blood vessel
Ethanol	University Medstore	39752-P016-EAAN	Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568	Invitrogen	A11004	For staining mature neurons
Graphpad prism 10	Graphpad prism 10	https://www.graphpad.com/	Statistical analysis software
Hamilton syringe	Sigma-aldrich	28614-U	Injection elastase
Heat pad	Amazon	https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ	Maintain body temperature
ImageJ software	Fiji Imagej software	imagej.net (USA)	Image analysis software
Induction chamber	Provided by animal facility	N/A	Anesthesia induction
Metacam	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Methyl salicylate	Sigma-aldrich	M6752	For removing the microfil
Microfil	Flow Tech, Carver, Massachusetts	https://www.flowtech-inc.com/order/	Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuN	Millipore Sigma	MAB377	For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.	Olympus Life Science	https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104	Imaging software
Paraformaldehyde	University Medstore	PAR070.1	For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pump	VWR International	https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps	Needed for perfusion
Scalpel	University Medstore	2580-M90-10	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxic	Provided by animal facility	N/A	So secure the animal for surgery
Surgical scissor	University Medstore	22751-A9-240	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tape	University Medstore	https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2	Secure the animal on the diaper
Sutures	University Medstore	2297-VS881	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezers	University Medstore	7731-A10-612	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)