A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

Abstract

הדם-מוח (BBB) היא מערכת חיונית המסדירה את זרימת המוח הסלקטיבית עם הפריפריה, כדוגמה, ומאפשרת לחומרים מזינים הדרושים להיכנס ולגרש חומצות אמינו מוגזמות או רעלים מהמוח. כדי להדגים כיצד BBB יכול להיפגע במחלות כמו דמנציה וסקולרית (VaD) או מחלת אלצהיימר (AD), חוקרים פיתחו שיטות חדשניות למדל הרחבת כלי דם. פגיעה ב-BBB במצבי מחלה אלה עלולה להיות מזיקה ולגרום לחוסר ויסות של BBB המוביל לתוצאות לא נעימות ופתולוגיות המשפיעות על תפקוד המוח. הצלחנו לשנות טכניקה קיימת שאפשרה לנו להזריק ישירות לתוך Cisterna magna (CM) כדי לגרום להרחבת כלי הדם באמצעות אלסטאז, ולשבש את הצמתים הצפופים (TJ) של BBB. בשיטה זו, הצלחנו לראות מדדים שונים של הצלחה על פני טכניקות קודמות, כולל הרחבת כלי דם עקבית, תמותה מופחתת או התאוששות משופרת, ושיפור חומר המילוי/אופציפיקציה, תרכובת גומי סיליקון, משלוח לתיוג כלי דם לניתוח הרחבה. שיטה זעיר פולשנית זו הניבה תוצאות מבטיחות, עם עלייה של 19%-32% בהתרחבות מתמשכת של כלי דם גדולים בעכברים בין שבועיים לשלושה חודשים לאחר ההזרקה. שיפור זה עומד בניגוד למחקרים קודמים, שהראו התרחבות מוגברת רק לאחר שבועיים. נתונים נוספים מצביעים על התרחבות מתמשכת גם לאחר 9.5 חודשים. עלייה זו אושרה על ידי השוואת קוטר כלי הדם של האלסטאז וקבוצת הרכב המוזרק. בסך הכל, טכניקה זו היא בעלת ערך לחקר הפרעות פתולוגיות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות מודלים של בעלי חיים.

Introduction

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המרפדים את נימי המוח הם המרכיבים העיקריים ליצירת מחסום הדם-מוח (BBB)1, אשר ממלא תפקיד מכריע בוויסות מה שנכנס או יוצא ממחזור הדם במוח עם הפריפריה. חומרים מזינים חיוניים הדרושים לרקמת העצבים מורשים להיכנס ל- BBB, בעוד שכמה חומצות אמינו חיוניות כמו גלוטמט מגורשות מהמוח, שכן ריכוזים גבוהים עלולים לגרום נזק עצבי מעורר קבוע לרקמת המוח2. בתנאים פיזיולוגיים רגילים, BBB מגביל את כמות חלבוני הפלזמה כמו אלבומין 3,4 ופרותרומבין מלהיכנס למוח, שכן אלה יכולים להיות בעלי השפעות מזיקות 5,6,7

Protocol

עכבריNL-F(בני 3 חודשים) המבטאים רובד עמילואיד אנושי ברמה פיזיולוגית שימשו למחקר זה, אם כי ניתן להשתמש במערכת זו עם כל מודל מכרסמים. כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של CAMH (פרוטוקול #843) והיו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. עכברים גודלו בבית והוחזקו במחזור אור-חושך של 12 שעות עם גישה ל-ad libitum לצ'או ולמים.

1. הליך הזרקת Cisterna magna (CM)

  1. הליך כירורגי
    1. הניחו את העכבר (APPNL-F, שני המינים, 3 חודשים) בתא זירוז הרדמה למשך דקה אחת.
      הערה: יש לשטוף את התא עם 5% איזופלורן מעורבב עם 1% חמצן למשך דקה אחת לפחות.
    2. לאח....

תוצאות

הצלחנו לאתר את ה- Cisterna magna מתחת לאזור העורפי של הגולגולת לאחר מיקמנו בזהירות את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית וניתחנו את השרירים. המבנה האנטומי הזה, שדומה למשולש הפוך ומודגש בצהוב, ממוקם מתחת לבסיס הגולגולת (איור 1). כדי להבטיח דיוק ולמנוע נזק לרקמת המוח, 1-2 מ"מ של שיפוע מזרק המ.......

Discussion

מאמר זה מדגים פרוטוקול משופר להרחבת כלי הדם במוח, ומספק גישה מדויקת ופשוטה להזרקת אלסטאז לתוך Cisterna magna של עכברים. נקודה אנטומית זו משמשת שער ישיר לנוזל השדרה, ומציעה אפיק רב ערך לחקר מחלות נוירולוגיות שונות. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה שונה זו הוא כי הזרקת מנה אחת של אלסטאז לתוך Cisterna magna.......

Disclosures

אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה התאפשר הודות לתרומות שלא יסולא בפז של סטפני טאם שסיפקה תמיכה בסיוע בניתוחים. אנו מודים לה מקרב לב על עזרתה. המכונים הלאומיים לבריאות (AG066162) לתמיכה במחקר זה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
23 G catheterUniversity Medstore2546-CABD305145Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanolUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szFor removing the microfil
Betadine scrub#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterilization
Betadine solutionAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterilization
BupivacaineProvided by animal facilityN/AAnalgesic
ClippersBrainTree Scientific IncCLP-41590Shave fur
Cotton Q-tipUniversity Medstore1962For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastaseSigma-aldrich E7885Used for the dilatation of blood vessel
EthanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568InvitrogenA11004For staining mature neurons
Graphpad prism 10Graphpad prism 10https://www.graphpad.com/Statistical analysis software
Hamilton syringeSigma-aldrich28614-UInjection elastase
Heat padAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZMaintain body temperature
ImageJ softwareFiji Imagej softwareimagej.net (USA)Image analysis software
Induction chamberProvided by animal facilityN/AAnesthesia induction
MetacamProvided by animal facilityN/AAnalgesic
Methyl salicylateSigma-aldrichM6752For removing the microfil
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/ Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuNMillipore SigmaMAB377For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104Imaging software
ParaformaldehydeUniversity MedstorePAR070.1For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pumpVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsNeeded for perfusion
ScalpelUniversity Medstore2580-M90-10For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
StereotaxicProvided by animal facilityN/ASo secure the animal for surgery
Surgical scissorUniversity Medstore22751-A9-240For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tapeUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Secure the animal on the diaper
SuturesUniversity Medstore2297-VS881For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezersUniversity Medstore7731-A10-612For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)

References

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69 (2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Cisterna Magna

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved