גישה חזותית לגרימת דוליכואקטזיה בעכברים כדי למדל תפקוד לקוי של כלי דם גדולים בתיווך כלי דם במוח

Summary

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

Abstract

הדם-מוח (BBB) היא מערכת חיונית המסדירה את זרימת המוח הסלקטיבית עם הפריפריה, כדוגמה, ומאפשרת לחומרים מזינים הדרושים להיכנס ולגרש חומצות אמינו מוגזמות או רעלים מהמוח. כדי להדגים כיצד BBB יכול להיפגע במחלות כמו דמנציה וסקולרית (VaD) או מחלת אלצהיימר (AD), חוקרים פיתחו שיטות חדשניות למדל הרחבת כלי דם. פגיעה ב-BBB במצבי מחלה אלה עלולה להיות מזיקה ולגרום לחוסר ויסות של BBB המוביל לתוצאות לא נעימות ופתולוגיות המשפיעות על תפקוד המוח. הצלחנו לשנות טכניקה קיימת שאפשרה לנו להזריק ישירות לתוך Cisterna magna (CM) כדי לגרום להרחבת כלי הדם באמצעות אלסטאז, ולשבש את הצמתים הצפופים (TJ) של BBB. בשיטה זו, הצלחנו לראות מדדים שונים של הצלחה על פני טכניקות קודמות, כולל הרחבת כלי דם עקבית, תמותה מופחתת או התאוששות משופרת, ושיפור חומר המילוי/אופציפיקציה, תרכובת גומי סיליקון, משלוח לתיוג כלי דם לניתוח הרחבה. שיטה זעיר פולשנית זו הניבה תוצאות מבטיחות, עם עלייה של 19%-32% בהתרחבות מתמשכת של כלי דם גדולים בעכברים בין שבועיים לשלושה חודשים לאחר ההזרקה. שיפור זה עומד בניגוד למחקרים קודמים, שהראו התרחבות מוגברת רק לאחר שבועיים. נתונים נוספים מצביעים על התרחבות מתמשכת גם לאחר 9.5 חודשים. עלייה זו אושרה על ידי השוואת קוטר כלי הדם של האלסטאז וקבוצת הרכב המוזרק. בסך הכל, טכניקה זו היא בעלת ערך לחקר הפרעות פתולוגיות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות מודלים של בעלי חיים.

Introduction

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המרפדים את נימי המוח הם המרכיבים העיקריים ליצירת מחסום הדם-מוח (BBB)¹, אשר ממלא תפקיד מכריע בוויסות מה שנכנס או יוצא ממחזור הדם במוח עם הפריפריה. חומרים מזינים חיוניים הדרושים לרקמת העצבים מורשים להיכנס ל- BBB, בעוד שכמה חומצות אמינו חיוניות כמו גלוטמט מגורשות מהמוח, שכן ריכוזים גבוהים עלולים לגרום נזק עצבי מעורר קבוע לרקמת המוח². בתנאים פיזיולוגיים רגילים, BBB מגביל את כמות חלבוני הפלזמה כמו אלבומין ^3,4 ופרותרומבין מלהיכנס למוח, שכן אלה יכולים להיות בעלי השפעות מזיקות ^5,6,7

Protocol

עכברי^NL-F(בני 3 חודשים) המבטאים רובד עמילואיד אנושי ברמה פיזיולוגית שימשו למחקר זה, אם כי ניתן להשתמש במערכת זו עם כל מודל מכרסמים. כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של CAMH (פרוטוקול #843) והיו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. עכברים גודלו בבית והוחזקו במחזור אור-חושך של 12 שעות עם גישה ל-ad libitum לצ'או ולמים.

1. הליך הזרקת Cisterna magna (CM)

1. הליך כירורגי
   1. הניחו את העכבר (APP^NL-F, שני המינים, 3 חודשים) בתא זירוז הרדמה למשך דקה אחת.
      הערה: יש לשטוף את התא עם 5% איזופלורן מעורבב עם 1% חמצן למשך דקה אחת לפחות.
   2. לאח....

תוצאות

הצלחנו לאתר את ה- Cisterna magna מתחת לאזור העורפי של הגולגולת לאחר מיקמנו בזהירות את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית וניתחנו את השרירים. המבנה האנטומי הזה, שדומה למשולש הפוך ומודגש בצהוב, ממוקם מתחת לבסיס הגולגולת (איור 1). כדי להבטיח דיוק ולמנוע נזק לרקמת המוח, 1-2 מ"מ של שיפוע מזרק המ.......

Discussion

מאמר זה מדגים פרוטוקול משופר להרחבת כלי הדם במוח, ומספק גישה מדויקת ופשוטה להזרקת אלסטאז לתוך Cisterna magna של עכברים. נקודה אנטומית זו משמשת שער ישיר לנוזל השדרה, ומציעה אפיק רב ערך לחקר מחלות נוירולוגיות שונות. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה שונה זו הוא כי הזרקת מנה אחת של אלסטאז לתוך Cisterna magna.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G catheter	University Medstore	2546-CABD305145	Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanol	University Medstore	https://www.uoftmedstore.com/index.sz	For removing the microfil
Betadine scrub	#	https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub	Sterilization
Betadine solution	Amazon	https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW	Sterilization
Bupivacaine	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Clippers	BrainTree Scientific Inc	CLP-41590	Shave fur
Cotton Q-tip	University Medstore	1962	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase	Sigma-aldrich	E7885	Used for the dilatation of blood vessel
Ethanol	University Medstore	39752-P016-EAAN	Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568	Invitrogen	A11004	For staining mature neurons
Graphpad prism 10	Graphpad prism 10	https://www.graphpad.com/	Statistical analysis software
Hamilton syringe	Sigma-aldrich	28614-U	Injection elastase
Heat pad	Amazon	https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ	Maintain body temperature
ImageJ software	Fiji Imagej software	imagej.net (USA)	Image analysis software
Induction chamber	Provided by animal facility	N/A	Anesthesia induction
Metacam	Provided by animal facility	N/A	Analgesic
Methyl salicylate	Sigma-aldrich	M6752	For removing the microfil
Microfil	Flow Tech, Carver, Massachusetts	https://www.flowtech-inc.com/order/	Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuN	Millipore Sigma	MAB377	For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.	Olympus Life Science	https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104	Imaging software
Paraformaldehyde	University Medstore	PAR070.1	For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pump	VWR International	https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps	Needed for perfusion
Scalpel	University Medstore	2580-M90-10	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxic	Provided by animal facility	N/A	So secure the animal for surgery
Surgical scissor	University Medstore	22751-A9-240	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tape	University Medstore	https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2	Secure the animal on the diaper
Sutures	University Medstore	2297-VS881	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezers	University Medstore	7731-A10-612	For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)