Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Vasküler demans ve Alzheimer hastalığı modellemesi için kullanılabilecek serebrovasküler disfonksiyonu araştırmak için bir model olarak farelerde kimyasal olarak indüklenen büyük kan damarı dilatasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca, silikon kauçuk bileşiği enjekte ederek ve kan damarı boyutundaki değişiklikleri ölçmek için net bir görsel rehberlik sağlayarak damar sistemini görselleştirmeyi de gösteriyoruz.

Özet

Kan-beyin (BBB), örneğin çevre ile seçici beyin dolaşımını düzenleyen, gerekli besinlerin beyinden aşırı amino asitlere veya toksinlere girmesine ve dışarı atılmasına izin veren çok önemli bir sistemdir. Vasküler demans (VaD) veya Alzheimer hastalığı (AD) gibi hastalıklarda BBB'nin nasıl tehlikeye atılabileceğini modellemek için araştırmacılar, damar dilatasyonunu modellemek için yeni yöntemler geliştirdiler. Bu hastalık durumlarında tehlikeye atılmış bir BBB zararlı olabilir ve BBB'nin düzensizliğine neden olabilir ve bu da beyin fonksiyonunu etkileyen istenmeyen ve patolojik sonuçlara yol açabilir. Elastaz kullanarak kan damarlarının dilatasyonunu indüklemek ve BBB'nin sıkı bağlantılarını (TJ) bozmak için doğrudan Cisterna magna'ya (CM) enjekte etmemizi sağlayan mevcut bir tekniği değiştirebildik. Bu yöntemle, tutarlı kan damarı dilatasyonu, azaltılmış mortalite veya daha iyi iyileşme ve bir silikon kauçuk bileşiği olan dolgu / opaklaştırıcı ajanın iyileştirilmesi, dilatasyon analizi için kan damarlarını etiketlemek için teslimat dahil olmak üzere önceki tekniklere göre çeşitli başarı ölçütleri görebildik. Bu modifiye minimal invaziv yöntem, farelerde enjeksiyondan 2 hafta ila 3 ay sonra büyük kan damarlarının sürekli genişlemesinde %19-32'lik bir artışla umut verici sonuçlar vermiştir. Bu iyileşme, yalnızca 2 haftalık işarette artan dilatasyon gösteren önceki çalışmalarla çelişmektedir. Ek veriler, 9,5 ay sonra bile genişlemenin devam ettiğini gösteriyor. Bu artış, elastaz ve araç enjekte edilen grubun kan damarlarının çapı karşılaştırılarak doğrulandı. Genel olarak, bu teknik, hayvan modelleri kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen patolojik bozuklukları incelemek için değerlidir.

Giriş

Serebral kılcal damarları kaplayan mikrovasküler endotel hücreleri, beyin dolaşımına çevre ile neyin girdiğini veya neyin çıktığını düzenlemede çok önemli bir rol oynayan kan-beyin bariyerini (BBB)1 oluşturmak için ana bileşenlerdir. Sinir dokusu için gerekli olan temel besin maddelerinin BBB'ye girmesine izin verilirken, glutamat gibi bazı esansiyel amino asitler beyinden atılır, çünkü yüksek konsantrasyonlar beyin dokusunda kalıcı nörouyarıcı hasara neden olabilir2. Normal fizyolojik koşullar altında, BBB, albümin 3,4 ve protrombin gibi plazma proteinlerinin be....

Protokol

Bu çalışma için insan amiloid plağını fizyolojik düzeyde eksprese eden AppNL-Ffareleri (3 aylık) kullanıldı, ancak bu sistem herhangi bir kemirgen modelinde kullanılabilir. Tüm hayvan prosedürleri, CAMH Hayvan Bakım Komitesi (Protokol # 843) tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerinin etik standartlarına uygun oldu. Fareler şirket içinde yetiştirildi ve yem ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde tutuldu.

1. Cisterna magna (CM) enjeksiyonu prosedürü

  1. Cerrahi prosedür
    1. Fareyi (APPNL-F, her iki cinsiyet, 3 ay) 1 dakika boy....

Temsili Sonuçlar

Fareyi stereotaksik çerçeveye dikkatlice yerleştirdikten ve kasları diseksiyon ettikten sonra Cisterna magna'yı kafatasının oksipital bölgesinin altına yerleştirmede başarılı olduk. Ters üçgeni andıran ve sarı renkle vurgulanan bu anatomik yapı, kafatasının tabanının altında yer almaktadır (Şekil 1). Hassasiyeti sağlamak ve beyin dokusuna herhangi bir zarar gelmesini önlemek için, Hamilton şırınga eğiminin 1-2 mm'si Cisterna magna'ya nazikçe yerleştirildi.

Tartışmalar

Bu makale, farelerin Cisterna magna'sına elastaz enjeksiyonu için kesin ve basit bir yaklaşım sağlayan serebrovasküler dilatasyon için geliştirilmiş bir protokolü göstermektedir. Bu anatomik nokta, beyin omurilik sıvısına doğrudan bir geçit görevi görür ve farklı nörolojik hastalıkların araştırılması için değerli bir yol sunar. Bu modifiye tekniğin ana avantajlarından biri, farelerin Cisterna magna'sına tek bir doz elastaz enjekte edilmesinin, tekrarlanabilir enjeksiyona veya bir kanül im.......

Açıklamalar

Çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, ameliyatlara yardımcı olma konusunda destek sağlayan Stephanie Tam'ın paha biçilmez katkılarıyla mümkün olmuştur. Kendisine yardımları için en içten şükranlarımızı sunarız. Bu araştırmayı desteklemek için Ulusal Sağlık Enstitüleri (AG066162).

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
23 G catheterUniversity Medstore2546-CABD305145Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanolUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szFor removing the microfil
Betadine scrub#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterilization
Betadine solutionAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterilization
BupivacaineProvided by animal facilityN/AAnalgesic
ClippersBrainTree Scientific IncCLP-41590Shave fur
Cotton Q-tipUniversity Medstore1962For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastaseSigma-aldrich E7885Used for the dilatation of blood vessel
EthanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568InvitrogenA11004For staining mature neurons
Graphpad prism 10Graphpad prism 10https://www.graphpad.com/Statistical analysis software
Hamilton syringeSigma-aldrich28614-UInjection elastase
Heat padAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZMaintain body temperature
ImageJ softwareFiji Imagej softwareimagej.net (USA)Image analysis software
Induction chamberProvided by animal facilityN/AAnesthesia induction
MetacamProvided by animal facilityN/AAnalgesic
Methyl salicylateSigma-aldrichM6752For removing the microfil
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/ Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuNMillipore SigmaMAB377For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104Imaging software
ParaformaldehydeUniversity MedstorePAR070.1For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pumpVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsNeeded for perfusion
ScalpelUniversity Medstore2580-M90-10For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
StereotaxicProvided by animal facilityN/ASo secure the animal for surgery
Surgical scissorUniversity Medstore22751-A9-240For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tapeUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Secure the animal on the diaper
SuturesUniversity Medstore2297-VS881For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezersUniversity Medstore7731-A10-612For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)

Referanslar

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69 (2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon