从全血中分离和冷冻保存高活力的人外周血单核细胞:初学者指南

摘要

该方案为收集、储存和解冻外周血单核细胞提供了可访问的指南，适用于下游分析和工作流程，如流式细胞术和 RNA 测序。还演示了等离子和血沉棕黄层收集。

摘要

外周血单核细胞 （PBMC） 通常用于免疫系统及其对疾病和病原体的反应的生物医学研究。该详细方案描述了从全血细胞中分离、冻存和解冻高质量和高活力 PBMC 的设备、用品和步骤，适用于流式细胞术和 RNA 测序等下游应用。还描述了与 PBMC 平行和同时处理全血血浆和血沉棕黄层的方案。该方案易于遵循，利用密度梯度离心分离 PBMC，并附有耗材、设备和制备步骤清单。该方案适用于具有实验室技术经验的个人，并且可以在临床或研究实验室中实施。由没有实验室经验的操作员使用该方案收集的 PBMC 产生高质量的细胞活力和 RNA 测序。

引言

该方案展示了一种从全血中分离外周血单核细胞 （PBMC） 的可行方法和工作流程。该方案特别针对新手研究技术人员、学生和临床实验室工作人员，目的是促进 PBMC 的收集和冷冻保存，而无需事先接受过实验室技术培训。

该方案利用离心法按密度分离全血的成分。全血由四种主要成分组成，按密度递减的顺序列出:红细胞/红细胞（占体积的 ~45%）、白细胞（体积的 <1%）、血小板（体积的 <1%）和血浆（体积的 ~55%）1,2,3,4,5,6。白细胞根据其细胞核特性可细分为两类:圆形或多核⁶。PBMC 定义为具有圆形细胞核的白细胞，由以下细胞类型组成:淋巴细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞）、树突状细胞和单核细胞⁶。多核白细胞包括粒细胞，粒细胞由以下细胞类型组成:中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞⁶。多核白细胞比 PBMC 更致密⁶。全血中每种成分的密度详见表 1。

在该方案中，将全血收集在密度梯度离心管中。这些试管包含密度为 1.077 g/mL 的预填充密度梯度培养基。离心后，密度梯度培养基将致密细胞（包括多核白细胞和红细胞）与 PBMC 和血小板分离（图 1A）^6,7。然后收集 PBMC 和血小板组分，洗涤并离心以去除血小板。收集所得纯化的PBMC并储存在-80°C或液氮中。冻存的 PBMC 可以活解冻并直接用于下游分析，或额外加工以分离特定成分细胞类型。

该方案已针对来自高活性 PBMC 的高质量 RNA 测序进行了优化。在本文中，从门诊患者的 PBMC 中分离和冷冻保存。随后，通过 FACS 从 PBMC 中分离单核细胞，并通过 RNA 测序进行分析。然而，该方案可以广泛适应其他实验需求，例如细胞培养、基因编辑、离体功能研究、单细胞分析、通过流式细胞术或飞行时间细胞术进行表型分析、DNA/RNA 或蛋白质的分离、免疫组织化学载玻片，其中包括 8,9,10,11,12,13,14,15， 16,17,18。

除了从密度梯度离心管中收集 PBMC 外，该方案还回顾了如何使用 EDTA 管通过离心收集血浆和血沉棕黄层。离心后，全血分离成血浆、红细胞和含有白细胞的称为血沉棕黄层的薄界面层（图 1B）⁶。血沉棕黄层通常用于 DNA 提取和随后的基因组分析^19,20。血浆层包含全血的无细胞成分，可用于生物标志物检测^21,22。

研究方案

该研究方案已获得 UCSD 和 KUMC 人类保护计划的批准，并符合赫尔辛基宣言。所有个体都提供了参与和采血的知情同意书。

1. PBMC 的处理和冻存

1. 采血前一天，打印出 表 2 中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。
   注:该方案设计用于收集 6 个密度梯度离心管。每管产生大约 1200 万个 PBMC，其中大约 50% 和 20% 分别是活淋巴细胞和单核细胞。根据实验需求进行相应扩展。请注意，细胞的绝对数量可能因患者或治疗条件而异。
2. 使用标准静脉切开技术，在 6 个密度梯度离心管和 1 个 EDTA 管中收集全血，直至充满，体积约为 6 mL。
   注意:如果需要来自多个患者或治疗条件的样品，收集的试管可以储存长达 4 小时，然后同时处理。
3. 收集后，在室温下以 1,800 x g 离心所有试管 20 分钟。
   注:有关如何操作离心机的演示，请参阅 补充视频 1 。
4. 离心后，小心地打开密度梯度离心管。使用移液管去除并丢弃含有血浆的半透明黄色层。不要干扰密度梯度培养基正上方的朦胧细胞层。谨慎起见，留下多余的血浆而不是丢弃 PBMC。对所有试管重复。
   注:离心含有密度梯度培养基的试管后，血浆和 PBMC 将高于密度梯度培养基;红细胞和粒细胞会沉降到底部。请参阅 图 1A 以获取可视化。
5. 使用新的移液管，将每管中剩余体积的含有细胞和残留血浆的移液轻轻上下移液至密度梯度培养基上方数倍。
6. 重悬后，将重悬的试管内容物移液到贴有标签的 50 mL 锥形管中。对所有试管重复上述步骤。
7. 将溶液 1（RPMI 培养基）倒入 50 mL 试管中，直至达到 50 mL 管线。
8. 根据需要，对每位患者或治疗条件重复步骤 1.4 至 1.7。
   注意:确保不同的样品不混合，并使用新的移液管以避免污染。
9. 在室温下以 300 x g 离心 50 mL 试管 10 分钟。
   注:第 2 节中详述的血浆和血沉棕黄层采集方案可在此期间完成。
10. 丢弃尽可能多的上清液。根据需要点击以去除残留的液滴。
    注:离心后，沉淀含有 PBMC，上清液含有血小板和残留血浆。
11. 将 15 mL 溶液 2 管（RPMI 培养基 + 12.5% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄吡啶醇）倒入含有 PBMC 沉淀的 50 mL 锥形管中。轻轻倒置试管以重悬细胞沉淀。
12. 使用移液管吸出 15 mL 溶液 3（RPMI 培养基 + 11.25% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄吡啶醇 + 10% DMSO）。逐滴加入 50 mL 试管中。
    注:溶液 3 含有 DMSO，在室温下对细胞有毒。在准备好立即处理之前，请勿添加解决方案 3。
13. 轻轻倒置试管 3 次以混合。
14. 使用多次分配移液器用 1 mL PBMC 填充每个预先标记和预冷却的冷冻管。
    注:有关如何操作多分液移液器的演示，请参阅 补充视频 2 。
15. 将冻存管放入预冷的冷冻容器中。然后，将容器移至 -80 °C 冰箱中。
16. 根据需要对每位患者或治疗条件重复步骤 1.9 至 1.13。
17. 将冻存管在冷冻容器内放置至少 12 小时，然后将它们转移到 -80 °C 的贴有标签的储存盒中。
    注:或者，将冷冻冻存管转移到液氮 （<-135 °C） 中进行长期储存。

2. EDTA 管等离子体和血沉棕黄层的加工

1. 在室温下以 1,800 x g 离心 10 分钟。
   注意:离心后，顶层由血浆组成，底层由红细胞组成，界面将是血沉棕黄层。有关可视化，请参见 图 1B 。
2. 使用新的移液管，在不干扰血沉棕黄层的情况下吸取尽可能多的血浆。然后，将 0.5 mL 等分试样分配到预先标记的冻存管中。吸出血沉棕黄层并将其转移到适当标记的冷冻管中。
   注意:一些血浆和红细胞可能会污染血沉棕黄层收集。
3. 根据需要对每个患者或治疗条件重复步骤 2.2。
4. 收集后，将冻存管储存在 -80 °C 冰箱中。
   注:或者，储存在液氮 （<-135 °C） 中长期储存。

3. 解冻 PBMC

1. 解冻前一天，打印出 表 3 中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。
   注:该方案设计用于解冻 1 根含有 1 mL PBMC 的 1.5 mL 试管。每管产生约 200 万个 PBMC，其中约 50% 和 20% 分别为活淋巴细胞和单核细胞。根据实验需求进行相应扩展。请注意，细胞的绝对数量可能因患者或治疗条件而异。
2. 使用干冰从储存中转移冷冻的 PBMC，并在 37 °C 培养箱中解冻 4 分钟，或在最后一次冰晶解冻之前解冻。
   注:如果需要，可以取等分试样进行细胞计数和活力测量，如第 4 节所述。
3. 解冻后，向每个冻存管中加入 1 mL 溶液 4 （PBS + 2 mM EDTA）。然后，将内容物倒入预先标记的 50 mL 试管中，每解冻一根 PBMC 试管，其中含有 10 mL 溶液 4。轻点以去除残留的液滴。
4. 将细胞过滤器放在空的 50 mL 试管上，然后将细胞悬液倒入细胞过滤器中。
   注意:如果需要，轻轻敲击以打破表面张力。
5. 在室温下以 400 x g 离心含有菌株细胞的每管 7 分钟。
6. 离心后，倒出含有 DMSO 的上清液。根据需要点击以去除残留的液滴。
7. 将细胞沉淀重悬于适合下游实验需要的所需培养基中（例如，细胞培养基、流式细胞术抗体混合物等）。

4. 细胞计数和活力

1. 在步骤 3.2 中解冻冷冻的 PBMC 后，立即将 20 μL 细胞移液到 1.5 mL 试管中。加入等体积的 0.4% 台盼蓝溶液，轻轻上下移液 3-4 次以混合。
2. 使用自动细胞计数仪，按照制造商的方案对细胞进行计数并评估活力。确保将稀释因子 2 考虑在内。
   注:如其他地方所述，血细胞计数器可用作评估细胞计数和活力的替代方法²³。

结果

PBMC 收集和冷冻保存后，按照制造商的说明，使用表 4 中列出的试剂通过流式细胞术评估来自 56 个独特样品的解冻 PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力（图 2A-F）。PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均 SD 活力分别为 94 ± 4.0%、98 ± 1.1% 和 93 ± 5.6%（图 2G）。±通过台盼蓝排除法测定活力，平均活力为 88 ± 7.5%，?...

讨论

该 PBMC 采集和冷冻保存方案已由接受过和未接受过研究实验室培训的个人成功实施。在我们的应用中，从储存的 PBMC 中纯化的高活力单核细胞的 FACS 和 RNA 测序产生了高质量的序列。

该协议的一个主要优势是它的可访问性。方案中介绍的技术利用预先填充有固体密度梯度介质的试管。因此，可以将全血直接收集到试管中，然后立即处理以分离 PBMC。需...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes