Aislamiento y criopreservación de células mononucleares de sangre periférica humana altamente viables a partir de sangre total: una guía para principiantes

Resumen

Este protocolo presenta una guía accesible para recolectar, almacenar y descongelar células mononucleares de sangre periférica adecuada para análisis posteriores y flujos de trabajo como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se muestran las colecciones de pelajes de plasma y buffy.

Resumen

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan habitualmente en la investigación biomédica sobre el sistema inmunitario y su respuesta a enfermedades y patógenos. Este protocolo detallado describe el equipo, los suministros y los pasos para aislar, criopreservar y descongelar PBMC de alta calidad y altamente viables a partir de células sanguíneas completas adecuadas para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se describen los protocolos para el procesamiento de plasma y capa leucocitaria de la sangre total en paralelo y simultáneamente con PBMC. Este protocolo paso a paso fácil de seguir, que utiliza la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las PBMC, va acompañado de una lista de verificación de suministros, equipos y pasos de preparación. Este protocolo es adecuado para personas con experiencia previa con técnicas de laboratorio y puede implementarse en laboratorios clínicos o de investigación. La viabilidad celular de alta calidad y la secuenciación del ARN fueron el resultado de PBMC recopilados por operadores sin experiencia previa en el laboratorio utilizando este protocolo.

Introducción

Este protocolo demuestra un método y un flujo de trabajo accesibles para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre completa. Este protocolo está especialmente dirigido a técnicos de investigación noveles, estudiantes y personal de laboratorio clínico con el objetivo de facilitar la recolección y criopreservación de PBMCs sin suponer una formación previa en técnicas de laboratorio.

Este protocolo utiliza la centrifugación para separar los componentes de la sangre total por densidad. La sangre total consta de cuatro componentes principales enumerados en orden decreciente de densidad: glóbulos rojos/eritrocitos (~45% del volumen), glóbulos blancos (<1% del volumen), plaquetas (<1% del volumen) y plasma (~55% del volumen)1,2,3,4,5,6. Los glóbulos blancos se pueden subdividir en dos categorías en función de las características de sus núcleos: redondos o multinucleados⁶. Las PBMC se definen como glóbulos blancos con núcleos redondos y constan de los siguientes tipos de células: linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK), linfocitos dendríticos y monocitos⁶. Los glóbulos blancos multinucleados incluyen granulocitos, que consisten en los siguientes tipos de células: neutrófilos, basófilos y eosinófilos⁶. Los glóbulos blancos multinucleados son más densos que los PBMC⁶. Las densidades de cada componente de la sangre total se detallan en la Tabla 1.

En este protocolo, la sangre entera se recolecta en tubos de centrifugación en gradiente de densidad. Estos tubos contienen un medio de gradiente de densidad preenvasado que tiene una densidad de 1,077 g/mL. Después de la centrifugación, las células más densas, incluidos los glóbulos blancos multinucleados y los eritrocitos, se separan de las PBMC y las plaquetas por el medio de gradiente de densidad (Figura 1A)^6,7. A continuación, se recoge, se lava y se centrifuga la PBMC y la fracción plaquetaria para eliminar las plaquetas. Los PBMC purificados resultantes se recogen y almacenan a -80 °C o en nitrógeno líquido. Las PBMC criopreservadas pueden descongelarse de forma viable y utilizarse directamente en análisis posteriores o procesarse adicionalmente para aislar tipos de células componentes específicas.

Este protocolo se ha optimizado para la secuenciación de ARN de alta calidad a partir de PBMC altamente viables. En este artículo, se aislaron y criopreservaron PBMC de pacientes en una clínica ambulatoria. Posteriormente, los monocitos se aislaron de PBMC mediante FACS y se analizaron mediante secuenciación de ARN. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse ampliamente a otras necesidades experimentales como el cultivo celular, la edición de genes, los estudios funcionales ex-vivo, los análisis de células individuales, el fenotipado por citometría de flujo o citometría por tiempo de vuelo, el aislamiento de ADN/ARN o proteínas, los portaobjetos para inmunohistoquímica, entre otros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Además de la recolección de PBMC de los tubos de centrifugación en gradiente de densidad, este protocolo revisa cómo recolectar plasma y capa leucocitaria mediante centrifugación usando un tubo de EDTA. Después de la centrifugación, la sangre entera se separa en plasma, eritrocitos y una fina capa de interfaz denominada capa leucocitaria que contiene leucocitos (Figura 1B)⁶. El pelaje leucocitario se utiliza habitualmente para la extracción de ADN y los posteriores análisis genómicos^19,20. La capa de plasma contiene los componentes libres de células de la sangre total y puede utilizarse para ensayos de biomarcadores ^21,22.

Protocolo

El protocolo del estudio fue aprobado por el Programa de Protección Humana de UCSD y KUMC y se ajusta a la Declaración de Helsinki. Todas las personas dieron su consentimiento informado para la participación y la recolección de sangre.

1. Procesamiento y criopreservación de PBMC

1. Un día antes de la recolección de sangre, imprima la lista de verificación de materiales y reactivos enumerados en la Tabla 2 y prepare y etiquete en consecuencia.
   NOTA: Este protocolo fue diseñado para la recolección de tubos de centrifugación de gradiente de 6 densidades. Cada tubo produce aproximadamente 12 millones de PBMC, de los cuales aproximadamente el 50% y el 20% serán linfocitos vivos y monocitos respectivamente. Escale en consecuencia para las necesidades experimentales. Tenga en cuenta que el número absoluto de células puede diferir significativamente entre pacientes o condiciones de tratamiento.
2. Utilizando la técnica de flebotomía estándar, recoja sangre completa en 6 tubos de centrifugación en gradiente de densidad y 1 tubo de EDTA hasta que se llene, aproximadamente 6 mL de volumen.
   NOTA: Si se requieren muestras de varios pacientes o condiciones de tratamiento, los tubos recolectados pueden almacenarse hasta 4 horas y luego procesarse simultáneamente.
3. Después de la recolección, centrifugar todos los tubos a 1.800 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Consulte el Video Suplementario 1 para obtener una demostración de cómo operar una centrífuga.
4. Después de la centrifugación, abra con cuidado el tubo de centrifugación de gradiente de densidad. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar y desechar la capa amarilla translúcida que contiene plasma. No moleste la capa nebulosa de células directamente sobre el medio de gradiente de densidad. Peca de precavido, dejando el exceso de plasma en lugar de desechar las PBMC. Repita para todos los tubos.
   NOTA: Después de la centrifugación del tubo que contiene el medio de gradiente de densidad, el plasma y los PBMC estarán por encima del medio de gradiente de densidad; Los eritrocitos y granulocitos se asentarán en el fondo. Consulte la Figura 1A para obtener una visualización.
5. Con una nueva pipeta de transferencia, pipetee suavemente el volumen restante que contiene células y plasma residual en cada tubo varias veces por encima del medio de gradiente de densidad.
6. Después de la resuspensión, pipetee el contenido resuspendido del tubo en un tubo cónico de 50 ml etiquetado. Repita para todos los tubos.
7. Vierta la solución 1 (medio RPMI) en el tubo de 50 mL hasta que alcance la línea de 50 mL.
8. Repita los pasos 1.4 a 1.7 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
   NOTA: Asegúrese de que no se mezclen diferentes muestras y utilice una pipeta de transferencia nueva para evitar la contaminación.
9. Centrifugar el tubo de 50 ml a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: El protocolo de recolección de plasma y leucemia detallado en la Sección 2 puede completarse durante este tiempo.
10. Deseche la mayor cantidad posible de sobrenadante. Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales.
    NOTA: Después de la centrifugación, el pellet contiene PBMC y el sobrenadante contiene plaquetas y plasma residual.
11. Vierta un tubo de 15 mL de solución 2 (medio RPMI + 12,5% de albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol) en el tubo cónico de 50 mL que contiene el pellet de PBMC. Invierta suavemente el tubo para volver a suspender el pellet de celda.
12. Aspirar 15 mL de solución 3 (medio RPMI + 11,25% albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol + 10% DMSO) con una pipeta de transferencia. Agregue gota a gota al tubo de 50 ml.
    NOTA: La solución 3 contiene DMSO, que es tóxico para las células a temperatura ambiente. No agregue la Solución 3 hasta que esté lista para ser procesada inmediatamente.
13. Invierta el tubo suavemente 3 veces para mezclar.
14. Llene cada criovial preetiquetado y preenfriado con 1 mL de PBMC utilizando una pipeta de dispensación múltiple.
    NOTA: Consulte el Video complementario 2 para ver una demostración de cómo operar una pipeta multidosificación.
15. Coloque los crioviales dentro de un recipiente de congelación preenfriado. A continuación, coloque el recipiente en un congelador a -80 °C.
16. Repita los pasos 1.9 a 1.13 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
17. Mantenga los crioviales dentro del recipiente de congelación durante un mínimo de 12 h, luego transfiéralos a una caja de almacenamiento etiquetada a -80 °C.
    NOTA: Alternativamente, transfiera los crioviales congelados a nitrógeno líquido (<-135 °C) para su almacenamiento a largo plazo.

2. Procesamiento de plasma y capa leucocitaria de tubos de EDTA

1. Centrifugar a 1.800 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Después de la centrifugación, la capa superior consta de plasma, la inferior contiene eritrocitos y la interfaz será la capa leucocitaria. Consulte la Figura 1B para ver una visualización.
2. Con una pipeta de transferencia nueva, extraiga la mayor cantidad de plasma posible sin alterar la capa de capa leucocitaria. A continuación, dispense alícuotas de 0,5 ml en crioviales premarcados. Aspire la capa de capa leucocitaria y transfiérala al criovial debidamente etiquetado.
   NOTA: Algunos plasmas y eritrocitos pueden contaminar la colección de pelaje leucitario.
3. Repita el paso 2.2 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
4. Después de la recolección, almacene los crioviales en un congelador a -80 °C.
   NOTA: Alternativamente, almacene en nitrógeno líquido (<-135 °C) para almacenamiento a largo plazo.

3. Descongelación de PBMC

1. Un día antes de descongelar, imprima una lista de verificación de los materiales y reactivos enumerados en la Tabla 3 y prepare y etiquete en consecuencia.
   NOTA: Este protocolo fue diseñado para la descongelación de 1 tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de PBMC. Cada tubo produce aproximadamente 2 millones de PBMC, de los cuales aproximadamente el 50% y el 20% serán linfocitos vivos y monocitos, respectivamente. Escale en consecuencia para las necesidades experimentales. Tenga en cuenta que el número absoluto de células puede diferir significativamente entre pacientes o condiciones de tratamiento.
2. Transfiera los PBMC congelados del almacenamiento con hielo seco y descongele en una incubadora a 37 °C durante 4 minutos, o justo antes de la descongelación del último cristal de hielo.
   NOTA: Si se desea, se puede tomar una alícuota para el recuento de células y las mediciones de viabilidad, como se detalla en la Sección 4.
3. Después de descongelar, agregue 1 mL de Solución 4 (PBS + 2 mM EDTA) a cada criovial. Luego, vierta el contenido en un tubo preetiquetado de 50 mL que contenga 10 mL de Solución 4 por cada tubo de PBMC descongelado. Toque para eliminar las gotas residuales.
4. Coloque el filtro de células en el tubo vacío de 50 ml y luego vierta la suspensión de células a través del filtro de células.
   NOTA: Si es necesario, golpee ligeramente para romper la tensión superficial.
5. Centrifugar cada tubo que contiene las células filtradas a 400 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
6. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante que contiene DMSO. Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales.
7. Vuelva a suspender el gránulo celular en el medio deseado apropiado para las necesidades experimentales posteriores (p. ej., medios de cultivo celular, cóctel de anticuerpos por citometría de flujo, etc.).

4. Recuento celular y viabilidad

1. Inmediatamente después de descongelar las PBMC congeladas en el paso 3.2, pipetee 20 μL de células en un tubo de 1,5 mL. Agregue un volumen igual de solución de Trypan Blue al 0,4% y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente 3-4 veces para mezclar.
2. Con un contador de células automatizado, siga el protocolo del fabricante para contar las células y evaluar la viabilidad. Asegúrese de tener en cuenta el factor de dilución de 2.
   NOTA: Como se ha descrito en otro lugar, un hemocitómetro puede utilizarse como método alternativo para evaluar el recuento de células y su viabilidad²³.

Resultados

Después de la recolección y criopreservación de PBMC, se evaluó la viabilidad de PBMC, monocitos y linfocitos descongelados de 56 muestras únicas mediante citometría de flujo utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 4 siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2A-F). Se logró una viabilidad media ± SD de PBMCs, monocitos y linfocitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% y 93 ± 5,6%, respectivamente (

Discusión

Este protocolo para la recolección y criopreservación de PBMC ha sido implementado con éxito por personas con y sin capacitación previa en laboratorio de investigación. En nuestra aplicación, la secuenciación de FACS y ARN de monocitos altamente viables purificados a partir de PBMC almacenados dio como resultado secuencias de alta calidad.

Una de las principales fortalezas de este protocolo es su accesibilidad. La técnica presentada en el protocolo uti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes