Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, aşağı akış analizleri ve akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi iş akışları için uygun periferik kan mononükleer hücrelerinin toplanması, saklanması ve çözülmesi için erişilebilir bir kılavuz sunar. Plazma ve buffy coat koleksiyonları da sergilenmektedir.

Özet

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), bağışıklık sistemi ve hastalık ve patojenlere tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, akış sitometrisi ve RNA dizilimi gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olan tam kan hücrelerinden yüksek kaliteli ve yüksek derecede canlı PBMC'leri izole etmek, kriyopreservasyon ve çözmek için ekipmanı, malzemeleri ve adımları açıklar. Tam kandan plazma ve buffy coat için PBMC'lerle paralel ve eş zamanlı olarak işleme protokolleri de tanımlanmıştır. PBMC'leri izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemeyi kullanan, takip etmesi kolay adım adım protokole, malzeme, ekipman ve hazırlık adımlarından oluşan bir kontrol listesi eşlik eder. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda daha önce herhangi bir deneyimi olan kişiler için uygundur ve klinik veya araştırma laboratuvarlarında uygulanabilir. Yüksek kaliteli hücre canlılığı ve RNA dizilimi, bu protokolü kullanarak daha önce laboratuvar deneyimi olmayan operatörler tarafından toplanan PBMC'lerden kaynaklandı.

Giriş

Bu protokol, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tam kandan izolasyonu için erişilebilir bir yöntem ve iş akışı gösterir. Bu protokol, laboratuvar teknikleri konusunda önceden eğitim almadan PBMC'lerin toplanmasını ve dondurularak saklanmasını kolaylaştırmak amacıyla özellikle acemi araştırma teknisyenlerine, öğrencilere ve klinik laboratuvar personeline yöneliktir.

Bu protokol, tam kanın bileşenlerini yoğunluğa göre ayırmak için santrifüjlemeyi kullanır. Tam kan, azalan yoğunluk sırasına göre listelenen dört ana bileşenden oluşur: kırmızı kan hücreleri/eritrositler (hacmin ~%45'i), beyaz kan hücreleri (hacmin %<1'i), trombositler (hacmin %<1'i) ve plazma (hacmin ~%55'i)1,2,3,4,5,6. Beyaz kan hücreleri, çekirdek özelliklerine göre iki kategoriye ayrılabilir: yuvarlak veya çok çekirdekli6. PBMC'ler yuvarlak çekirdekli beyaz kan hücreleri olarak tanımlanır ve aşağıdaki hücre tiplerinden oluşur: lenfositler (T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri), dendritik hücreler ve monositler6. Çok çekirdekli beyaz kan hücreleri, aşağıdaki hücre tiplerinden oluşan granülositleri içerir: nötrofiller, bazofiller ve eozinofiller6. Çok çekirdekli beyaz kan hücreleri PBMC'lerden daha yoğundur6. Tam kanın her bir bileşeninin yoğunlukları Tablo 1'de detaylandırılmıştır.

Bu protokolde tam kan, yoğunluk gradyanlı santrifüj tüplerinde toplanır. Bu tüpler, yoğunluğu 1.077 g/mL olan önceden paketlenmiş bir yoğunluk gradyan ortamı içerir. Santrifüjlemeyi takiben, çok çekirdekli beyaz kan hücreleri ve eritrositler dahil olmak üzere daha yoğun hücreler, yoğunluk gradyan ortamı ile PBMC'lerden ve trombositlerden ayrılır (Şekil 1A)6,7. PBMC ve trombosit fraksiyonu daha sonra toplanır, yıkanır ve trombositleri çıkarmak için santrifüjlenir. Elde edilen saflaştırılmış PBMC'ler -80 °C'de veya sıvı nitrojen içinde toplanır ve saklanır. Dondurularak saklanmış PBMC'ler canlı bir şekilde çözülebilir ve doğrudan aşağı akış analizlerinde kullanılabilir veya belirli bileşen hücre tiplerini izole etmek için ek olarak işlenebilir.

Bu protokol, son derece uygulanabilir PBMC'lerden yüksek kaliteli RNA dizilimi için optimize edilmiştir. Bu makalede, PBMC'ler bir poliklinikte hastalardan izole edildi ve dondurularak saklandı. Daha sonra, monositler FACS ile PBMC'lerden izole edildi ve RNA dizileme yoluyla analiz edildi. Bununla birlikte, protokol, hücre kültürü, gen düzenleme, ex-vivo fonksiyonel çalışmalar, tek hücre analizleri, uçuş zamanına göre akış sitometrisi veya sitometri ile fenotipleme, DNA / RNA veya proteinlerin izolasyonu, immünohistokimya için slaytlar gibi diğer deneysel ihtiyaçlara geniş çapta uyarlanabilir 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Yoğunluk gradyanlı santrifüj tüplerinden PBMC toplamaya ek olarak, bu protokol, bir EDTA tüpü kullanılarak santrifüjleme yoluyla plazma ve buffy coat nasıl toplanacağını gözden geçirir. Santrifüj işleminden sonra tam kan plazma, eritrositler ve lökosit içeren buffy coat adı verilen ince bir arayüz tabakasına ayrılır (Şekil 1B)6. Buffy ceket, DNA ekstraksiyonu ve sonraki genomik analizler için yaygın olarak kullanılır19,20. Plazma tabakası, tam kanın hücresiz bileşenlerini içerir ve biyobelirteç testleri için kullanılabilir21,22.

Protokol

Çalışma protokolü UCSD ve KUMC İnsan Koruma Programı tarafından onaylanmıştır ve Helsinki Bildirgesi'ne uygundur. Tüm bireyler katılım ve kan alımı için bilgilendirilmiş onam verdi.

1. PBMC'lerin işlenmesi ve dondurularak saklanması

  1. Kan alımından bir gün önce, Tablo 2'de listelenen malzeme ve reaktiflerin kontrol listesini yazdırın ve buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
    NOT: Bu protokol, 6 yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünün toplanması için tasarlanmıştır. Her tüp yaklaşık 12 milyon PBMC verir ve bunların yaklaşık %50'si ve %20'si sırasıyla canlı lenfositler ve monositler olacaktır. Deneysel ihtiyaçlar için uygun şekilde ölçeklendirin. Mutlak hücre sayısının hastalar veya tedavi koşulları arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğini unutmayın.
  2. Standart flebotomi tekniğini kullanarak, tam kanı 6 yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünde ve 1 EDTA tüpünde yaklaşık 6 mL hacim dolana kadar toplayın.
    NOT: Birden fazla hastadan veya tedavi koşullarından alınan numuneler gerekiyorsa, toplanan tüpler 4 saate kadar saklanabilir ve daha sonra aynı anda işlenebilir.
  3. Toplandıktan sonra, tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bir santrifüjün nasıl çalıştırılacağına dair bir gösteri için Ek Video 1'e bakın.
  4. Santrifüjlemeden sonra, yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünü dikkatlice açın. Plazma içeren yarı saydam sarı tabakayı çıkarmak ve atmak için bir transfer pipeti kullanın. Puslu hücre tabakasını doğrudan yoğunluk gradyan ortamının üzerinde rahatsız etmeyin. Dikkatli olun, PBMC'leri atmak yerine fazla plazma bırakın. Tüm tüpler için tekrarlayın.
    NOT: Yoğunluk gradyan ortamını içeren tüpün santrifüjlenmesinden sonra, plazma ve PBMC'ler yoğunluk gradyan ortamının üzerinde olacaktır; Eritrositler ve granülositler dibe çökecektir. Görselleştirme için Şekil 1A'ya bakın.
  5. Yeni bir transfer pipeti ile, her tüpte kalan hacmi içeren hücreleri ve artık plazmayı, yoğunluk gradyan ortamının üzerinde birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  6. Yeniden süspansiyondan sonra, tüpün yeniden askıya alınmış içeriğini etiketli 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Tüm tüpler için tekrarlayın.
  7. Çözelti 1'i (RPMI Medium) 50 mL çizgisine ulaşana kadar 50 mL'lik tüpe dökün.
  8. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için 1.4 ila 1.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Farklı numunelerin karıştırılmadığından emin olun ve kontaminasyonu önlemek için yeni bir transfer pipeti kullanın.
  9. 50 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bölüm 2'de detaylandırılan plazma ve buffy toplama protokolü bu süre zarfında tamamlanabilir.
  10. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı atın. Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, pelet PBMC'ler içerir ve süpernatant trombositler ve artık plazma içerir.
  11. PBMC peletini içeren 50 mL konik tüpe 15 mL'lik bir Çözelti 2 tüpü (RPMI Orta +% 12.5 İnsan Serum Albümini + 1 μM Flavopiridol) dökün. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için tüpü yavaşça ters çevirin.
  12. Bir transfer pipeti kullanarak 15 mL Çözelti 3'ü (RPMI Orta +% 11.25 İnsan Serum Albümini + 1 μM Flavopiridol +% 10 DMSO) aspire edin. 50 mL'lik tüpe damla damla ekleyin.
    NOT: Çözelti 3, oda sıcaklığında hücreler için toksik olan DMSO içerir. Hemen işlenmeye hazır olana kadar Çözüm 3'ü eklemeyin.
  13. Karıştırmak için tüpü 3 kez hafifçe ters çevirin.
  14. Önceden etiketlenmiş ve önceden soğutulmuş her bir kriyoviali, çok dağıtımlı bir pipet kullanarak 1 mL PBMC ile doldurun.
    NOT: Çok dağıtımlı bir pipetin nasıl çalıştırılacağına ilişkin bir gösteri için Ek Video 2'ye bakın.
  15. Kriyovialleri önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin. Ardından kabı -80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın.
  16. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için 1.9 ila 1.13 arasındaki adımları tekrarlayın.
  17. Kriyoviyalleri dondurma kabının içinde en az 12 saat tutun, ardından -80 °C'de etiketli bir saklama kutusuna aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, donmuş kriyoviyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene (<-135 °C) aktarın.

2. EDTA tüplerinden plazma ve buffy coat işlenmesi

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst tabaka plazmadan oluşur, alt tabaka eritrositler içerir ve arayüz buffy coat olacaktır. Görselleştirme için Şekil 1B'ye bakın.
  2. Yeni bir transfer pipeti kullanarak, buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca çok plazma hazırlayın. Ardından, 0.5 mL alikotları önceden etiketlenmiş kriyoviyallere dağıtın. Buffy coat tabakasını aspire edin ve uygun şekilde etiketlenmiş kriyoviyal katmana aktarın.
    NOT: Bazı plazma ve eritrositler buffy coat koleksiyonunu kontamine edebilir.
  3. Gerektiğinde her hasta veya tedavi durumu için adım 2.2'yi tekrarlayın.
  4. Toplandıktan sonra kriyovialleri -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    NOT: Alternatif olarak, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen (<-135 °C) içinde saklayın.

3. PBMC'lerin çözülmesi

  1. Çözdürmeden bir gün önce, Tablo 3'te listelenen malzeme ve reaktiflerin bir kontrol listesini yazdırın ve buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
    NOT: Bu protokol, 1 mL PBMC içeren 1 1.5 mL tüpün çözülmesi için tasarlanmıştır. Her tüp yaklaşık 2 milyon PBMC verir ve bunların yaklaşık %50'si ve %20'si sırasıyla canlı lenfositler ve monositler olacaktır. Deneysel ihtiyaçlar için uygun şekilde ölçeklendirin. Mutlak hücre sayısının hastalar veya tedavi koşulları arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğini unutmayın.
  2. Dondurulmuş PBMC'leri kuru buz kullanarak depodan aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatörde 4 dakika veya son buz kristalinin çözülmesinden hemen önce çözdürün.
    NOT: İstenirse, Bölüm 4'te detaylandırıldığı gibi hücre sayımı ve canlılık ölçümleri için bir alikot alınabilir.
  3. Çözüldükten sonra, her kriyovial'e 1 mL Çözelti 4 (PBS + 2 mM EDTA) ekleyin. Ardından, içeriği, çözülen her PBMC tüpü için 10 mL Çözelti 4 içeren önceden etiketlenmiş 50 mL'lik bir tüpe dökün. Kalan damlaları çıkarmak için dokunun.
  4. Hücre süzgecini boş 50 mL'lik tüpe yerleştirin ve ardından hücre süspansiyonunu hücre süzgecinden dökün.
    NOT: Gerekirse, yüzey gerilimini kırmak için hafifçe vurun.
  5. Süzülmüş hücreleri içeren her bir tüpü oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
  6. Santrifüjlemeden sonra, DMSO içeren süpernatanı dökün. Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun.
  7. Hücre peletini, aşağı akış deneysel ihtiyaçları için uygun olan istenen ortamda (örneğin, hücre kültürü ortamı, akış sitometrisi, antikor kokteyli, vb.) yeniden süspanse edin.

4. Hücre sayımı ve canlılığı

  1. Adım 3.2'de donmuş PBMC'ler çözüldükten hemen sonra, 20 μL hücreyi 1.5 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Eşit hacimde %0,4 Tripan Mavisi çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için 3-4 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  2. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücreleri saymak ve canlılığı değerlendirmek için üreticinin protokolünü izleyin. 2 seyreltme faktörünün hesaba katıldığından emin olun.
    NOT: Başka bir yerde açıklandığı gibi, hücre sayısını ve canlılığını değerlendirmek için alternatif bir yöntem olarak bir hemositometrekullanılabilir 23.

Sonuçlar

PBMC toplama ve kriyoprezervasyonun ardından, 56 benzersiz numuneden çözülmüş PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin canlılığı, üreticilerin talimatlarına göre Tablo 4'te listelenen reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi (Şekil 2A-F). PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin sırasıyla %94 ± %4.0, %98 ± %1.1 ve %93 ± %5.6 arasında ortalama ± bir SD canlılığı elde edilmiş...

Tartışmalar

PBMC toplama ve kriyoprezervasyon için bu protokol, önceden araştırma laboratuvarı eğitimi almış ve almamış kişiler tarafından başarıyla uygulanmıştır. Uygulamamızda, depolanmış PBMC'lerden saflaştırılan yüksek derecede canlı monositlerin FACS ve RNA dizilemesi, yüksek kaliteli dizilerle sonuçlandı.

Bu protokolün önemli bir gücü erişilebilirliğidir. Protokolde sunulan teknik, katı yoğunluklu gradyan bir ortamla önceden pake...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek ilgili finansal veya finansal olmayan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Rızalarını, zamanlarını ve kan örneklerini bağışlamalarını gönüllü olarak veren hastalara teşekkür ederiz. Ayrıca Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton ve Mark McClellen'a işbirlikleri ve bu protokolü uzak bir yerde uyguladıkları için teşekkür ederiz. CY, NIH hibesi 1K08HL150271'den araştırma desteği aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL TipsGilsonF174501Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tubeBiopioneeerCNT-15To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL TipsGilsonF174201For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical TubeCEM Corporation50-187-76832 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 AntibodyBiolegend360723
CD19 AntibodyBiolegend363007
CD3 AntibodyBiolegend300405
CD56 AntibodyBiolegend318303
CD66b AntibodyBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation TubeBD Biosciences3627536 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Holds 81 tubes
1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Holds up to 50 cryovials
DMSOInvitrogen15575020Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10977015Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA TubesBD Biosciences3666431 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntibodyBiolegend307609
Human Serum AlbuminGeminiBio800-120Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KFor use in Mr. Frosty
Label PrinterPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Holds up to 18 tubes.
2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MFor use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer LabelsPhomemoPM-M110-3020Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)InvitrogenAM9260GApproximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVApproximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MApproximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes

Referanslar

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. . Physiology, Blood Plasma. , (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520 (2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. . The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. . Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322 (2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67 (2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341 (2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45 (2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56 (2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356 (2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672 (2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843 (2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72 (2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980 (2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489 (2022).
  25. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48 (2015).
  26. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  27. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  28. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154 (2021).
  29. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  30. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119 (2021).
  31. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118 (2022).
  32. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC). IEEE. , 6228-6231 (2013).
  33. Chen, X., Thibeault, S. abc. , 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6 (2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081 (2021).
  36. Chao, S. -. H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944 (2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır