בידוד ושימור בהקפאה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי יכולת קיימא גבוהה מדם שלם: מדריך למתחילים

Summary

פרוטוקול זה מציג מדריך נגיש לאיסוף, אחסון והפשרה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים המתאימים לניתוחים ותהליכי עבודה במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. קולקציות פלזמה ומעילים באפי מודגמות גם כן.

Abstract

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משמשים בדרך כלל במחקר ביו-רפואי על מערכת החיסון ותגובתה למחלות ופתוגנים. פרוטוקול מפורט זה מתאר את הציוד, האספקה והצעדים לבידוד, שימור הקפאה והפשרה של PBMCs באיכות גבוהה ובת קיימא ביותר מתאי דם שלמים המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. מתוארים גם פרוטוקולים לעיבוד פלזמה ופרווה באפי מכל הדם במקביל ובמקביל למרכזיות. פרוטוקול שלב אחר שלב קל לביצוע, המשתמש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות כדי לבודד PBMCs, מלווה ברשימת תיוג של אספקה, ציוד ושלבי הכנה. פרוטוקול זה מתאים לאנשים עם ניסיון קודם בטכניקות מעבדה וניתן ליישמו במעבדות קליניות או מחקריות. איכות גבוהה של קיום תאים וריצוף RNA נבעו ממרכזיות שנאספו על ידי מפעילים ללא ניסיון מעבדה קודם בשימוש בפרוטוקול זה.

Introduction

פרוטוקול זה מדגים שיטה וזרימת עבודה נגישה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם שלם. פרוטוקול זה מיועד במיוחד לטכנאי מחקר מתחילים, סטודנטים וצוות מעבדה קלינית במטרה להקל על איסוף ושימור בהקפאה של PBMCs מבלי להניח הכשרה מוקדמת בטכניקות מעבדה.

פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה כדי להפריד את מרכיבי הדם המלא לפי צפיפות. דם שלם מורכב מארבעה מרכיבים עיקריים המפורטים לפי סדר ירידת הצפיפות: תאי דם אדומים/אריתרוציטים (~45% מהנפח), תאי דם לבנים (<1% מהנפח), טסיות דם (<1% מהנפח) ופלזמה (~55% מהנפח)1,2,3,4,5,6. ניתן לחלק את תאי הדם הלבנים לשתי קטגוריות על פי מאפייני הגרעינים שלהם: עגולים או מרובי גרעינים⁶. PBMCs מוגדרים כתאי דם לבנים עם גרעינים עגולים ומורכבים מסוגי התאים הבאים: לימפוציטים (תאי T, תאי B, תאי NK), תאים דנדריטיים ומונוציטים⁶. תאי דם לבנים מרובי גרעינים כוללים גרנולוציטים, המורכבים מסוגי התאים הבאים: נויטרופילים, בזופילים ואאוזינופילים⁶. תאי דם לבנים מרובי גרעינים צפופים יותר מאשר PBMCs⁶. הצפיפויות של כל מרכיב בדם שלם מפורטות בטבלה 1.

בפרוטוקול זה, דם שלם נאסף בצינורות צנטריפוגות הדרגתיות בצפיפות. צינורות אלה מכילים מדיום שיפוע צפיפות ארוז מראש בעל צפיפות של 1.077 גרם / מ"ל. לאחר צנטריפוגה, תאים צפופים יותר, כולל תאי דם לבנים מרובי גרעינים ואריתרוציטים, מופרדים ממרכזיות מרכזיות ומטסיות דם על-ידי מדיום שיפוע הצפיפות (איור 1A)^6,7. לאחר מכן נאספים, נשטפים וצנטריפוגות ה-PBMC והטסיות כדי להסיר טסיות. PBMCs מטוהרים כתוצאה מכך נאספים ומאוחסנים ב -80 ° C או בחנקן נוזלי. PBMCs שמורים בהקפאה עשויים להיות מופשרים באופן בר-קיימא ולשמש ישירות בניתוחים במורד הזרם, או בנוסף מעובדים כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים של רכיבים.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף RNA באיכות גבוהה ממרכזיות PBMC בנות קיימא ביותר. במאמר זה, PBMCs בודדו ונשמרו בהקפאה ממטופלים במרפאת חוץ. לאחר מכן, מונוציטים בודדו מ-PBMCs על ידי FACS ונותחו באמצעות ריצוף RNA. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם באופן נרחב לצרכים ניסיוניים אחרים כגון תרבית תאים, עריכת גנים, מחקרים פונקציונליים ex-vivo, אנליזות תא בודד, פנוטיפ על ידי ציטומטריה זרימה או ציטומטריה בזמן הטיסה, בידוד של DNA / RNA או חלבונים, שקופיות עבור immunohistochemistry, בין היתר 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

בנוסף לאיסוף PBMC מצינורות צנטריפוגות שיפוע צפיפות, פרוטוקול זה סוקר כיצד לאסוף פלזמה וציפוי באפי באמצעות צנטריפוגה באמצעות צינור EDTA. לאחר צנטריפוגה, דם שלם מופרד לפלזמה, אריתרוציטים ושכבת ממשק דקה שנקראת מעיל באפי שמכילה לויקוציטים (איור 1B)⁶. המעיל האפי משמש בדרך כלל למיצוי DNA ולניתוחים גנומיים עוקבים^19,20. שכבת הפלזמה מכילה את המרכיבים נטולי התאים של דם שלם וניתן להשתמש בה לבדיקות סמנים ביולוגיים^21,22.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי UCSD ו- KUMC Human Protections Program ותואם את הצהרת הלסינקי. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתפות ואיסוף דם.

1. עיבוד ושימור בהקפאה של PBMCs

1. יום לפני איסוף הדם, הדפיסו את רשימת החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 2 והכינו ותייגו בהתאם.
   הערה: פרוטוקול זה תוכנן לאיסוף של 6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות. כל צינור מניב כ-12 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% לימפוציטים חיים ומונוציטים בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
2. באמצעות טכניקת הפלבוטומיה הסטנדרטית, יש לאסוף דם שלם ב-6 צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות וצינור EDTA אחד עד למילוי, כ-6 מ"ל נפח.
   הערה: אם נדרשות דגימות ממטופלים מרובים או ממצבי טיפול, ניתן לאחסן את הצינורות שנאספו עד 4 שעות ולאחר מכן לעבד אותם בו-זמנית.
3. לאחר האיסוף, צנטריפוגו את כל הצינורות במהירות של 1,800 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: עיין בסרטון המשלים 1 להדגמה כיצד להפעיל צנטריפוגה.
4. לאחר הצנטריפוגה, פתח בזהירות את צינור הצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר ולהשליך את השכבה הצהובה השקופה המכילה פלזמה. אין להפריע לשכבת התאים המעורפלת ישירות מעל מדיום שיפוע הצפיפות. יש לטעות בצד הזהירות, ולהשאיר עודפי פלזמה במקום להשליך PBMCs. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
   הערה: לאחר צנטריפוגה של הצינור המכיל את תווך שיפוע הצפיפות, פלזמה ו- PBMCs יהיו מעל תווך שיפוע הצפיפות; אריתרוציטים וגרנולוציטים ישקעו לתחתית. עיינו באיור 1A להמחשה.
5. עם פיפטת העברה חדשה, פיפטה את הנפח הנותר המכיל תאים ושאריות פלזמה בכל צינור למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים מעל מדיום שיפוע הצפיפות.
6. לאחר ההשעיה, פיפטה את התוכן resuspended של הצינור לתוך צינור חרוטי מסומן 50 מ"ל. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
7. יוצקים את תמיסה 1 (RPMI Medium) לתוך צינור 50 מ"ל עד שהוא מגיע לקו 50 מ"ל.
8. חזור על שלבים 1.4 עד 1.7 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
   הערה: ודא שדגימות שונות אינן מעורבבות והשתמש בפיפטת העברה חדשה כדי למנוע זיהום.
9. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: פרוטוקול איסוף הפלזמה והבאפי המפורט בסעיף 2 עשוי להסתיים במהלך תקופה זו.
10. השליכו כמה שיותר סופרנאטנט. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, הגלולה מכילה PBMCs, והסופרנאטנט מכיל טסיות דם ושאריות פלזמה.
11. יוצקים צינור 15 מ"ל של תמיסה 2 (RPMI בינוני + 12.5% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר Flavopiridol) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את גלולת PBMC. הפוך בעדינות את הצינור כדי להשהות מחדש את גלולת התא.
12. שאפו 15 מ"ל של תמיסה 3 (RPMI בינוני + 11.25% אלבומין בסרום אנושי + 1 מיקרומטר פלבופירידול + 10% DMSO) באמצעות פיפטה העברה. הוסף טיפה לצינור 50 מ"ל.
    הערה: תמיסה 3 מכילה DMSO, שהוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר. אל תוסיף פתרון 3 עד שהוא מוכן לעיבוד מיידי.
13. הפכו את הצינור בעדינות 3 פעמים כדי לערבב.
14. מלאו כל קריוביאל מסומן מראש ומקורר מראש ב-1 מ"ל PBMCs באמצעות פיפטה מרובת מנות.
    הערה: עיין בסרטון המשלים 2 כדי להדגים כיצד להפעיל פיפטה מרובת שירותים.
15. הניחו את הקריובלים בתוך מיכל הקפאה מקורר מראש. לאחר מכן, העבירו את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
16. חזור על שלבים 1.9 עד 1.13 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
17. שמור את הקריובלים בתוך מיכל ההקפאה למשך 12 שעות לפחות, ולאחר מכן העבר אותם לקופסת אחסון מסומנת בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לחלופין, העבר את הקריובלים הקפואים לחנקן נוזלי (<-135 ° C) לאחסון לטווח ארוך.

2. עיבוד פלזמה ופרווה באפי מצינורות EDTA

1. צנטריפוגה במהירות 1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, השכבה העליונה מורכבת פלזמה, התחתון מכיל אריתרוציטים, ואת הממשק יהיה מעיל באפי. ראו איור 1B להמחשה.
2. בעזרת פיפטת העברה חדשה, ציירו כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת הפרווה הבאפי. לאחר מכן, לחלק 0.5 מ"ל aliquots לתוך cryovials מראש. שאפו את שכבת הפרווה הבאפית והעבירו אותה לקריביאל המסומן כראוי.
   הערה: חלק מהפלזמה והאריתרוציטים עלולים לזהם את אוסף מעילי הבאפי.
3. חזור על שלב 2.2 עבור כל מטופל או מצב טיפול לפי הצורך.
4. לאחר האיסוף, יש לאחסן את הקריובלים במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
   הערה: לחלופין, יש לאחסן בחנקן נוזלי (<-135°C לאחסון לטווח ארוך.

3. הפשרת מרכזיות

1. יום לפני ההפשרה, הדפיסו רשימת חומרים וריאגנטים המפורטים בטבלה 3 והכינו ותייגו בהתאם.
   הערה: פרוטוקול זה תוכנן להפשרה של צינור 1 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל PBMCs. כל צינור מניב כ-2 מיליון PBMCs, מתוכם כ-50% ו-20% יהיו לימפוציטים חיים ומונוציטים, בהתאמה. התרחב בהתאם לצרכים ניסיוניים. שים לב שהמספר המוחלט של תאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין חולים או מצבי טיפול.
2. מעבירים PBMC קפואים מהאחסון באמצעות קרח יבש ומפשירים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, או ממש לפני הפשרת גבישי הקרח האחרונה.
   הערה: אם תרצה, ניתן לקחת aliquot עבור ספירת תאים ומדידות כדאיות, כמפורט בסעיף 4.
3. לאחר ההפשרה, הוסף 1 מ"ל של תמיסה 4 (PBS + 2 mM EDTA) לכל קריוביאלי. לאחר מכן, שפכו את התוכן לתוך צינור 50 מ"ל מסומן מראש המכיל 10 מ"ל של תמיסה 4 עבור כל צינור PBMC מופשר. הקש כדי להסיר טיפות שיורית.
4. הניחו את מסננת התא על הצינור הריק של 50 מ"ל ולאחר מכן שפכו את תרחיף התא דרך מסננת התא.
   הערה: במידת הצורך, הקש קלות כדי לשבור את מתח פני השטח.
5. צנטריפוגה כל צינור המכיל את התאים המתוחים ב 400 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
6. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים החוצה את supernatant המכיל DMSO. יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות.
7. יש להשהות מחדש את כדורית התא בתווך הרצוי המתאים לצרכים ניסיוניים במורד הזרם (למשל, מדיה של תרבית תאים, קוקטייל נוגדנים ציטומטריית זרימה וכו').

4. ספירת תאים וכדאיות

1. מיד לאחר הפשרת PBMCs קפואים בשלב 3.2, פיפטה 20 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל. מוסיפים נפח שווה של 0.4% תמיסת Trypan Blue ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות 3-4 פעמים כדי לערבב.
2. באמצעות מונה תאים אוטומטי, עקוב אחר פרוטוקול היצרן כדי לספור תאים ולהעריך כדאיות. ודא כי גורם דילול של 2 נלקח בחשבון.
   הערה: כפי שמתואר במקום אחר, ניתן להשתמש בהמוציטומטר כשיטה חלופית להערכת ספירת תאים וכדאיות²³.

תוצאות

לאחר איסוף PBMC ושימור בהקפאה, הכדאיות של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים מופשרים מ-56 דגימות ייחודיות הוערכה על-ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ריאגנטים המפורטים בטבלה 4 בהתאם להוראות היצרן (איור 2A-F). הושגה כדאיות ממוצעת ± SD של PBMCs, מונוציטים ולימ?...

Discussion

פרוטוקול זה לאיסוף PBMC ושימור בהקפאה יושם בהצלחה על ידי אנשים עם וללא הכשרה קודמת במעבדת מחקר. ביישום שלנו, FACS וריצוף RNA של מונוציטים בני קיימא ביותר שטוהרו מ- PBMCs מאוחסנים הביאו לרצפים באיכות גבוהה.

חוזקה עיקרית של פרוטוקול זה היא נגישותו. הטכניקה המוצגת בפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes