Isolement et cryoconservation de cellules mononucléées du sang périphérique humain hautement viables à partir de sang total : un guide pour les débutants

Résumé

Ce protocole présente un guide accessible pour la collecte, le stockage et la décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique, adapté aux analyses en aval et aux flux de travail tels que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des collections de plasma et de couche leucocytaire sont également présentées.

Résumé

Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont couramment utilisées dans la recherche biomédicale sur le système immunitaire et sa réponse aux maladies et aux agents pathogènes. Ce protocole détaillé décrit l’équipement, les fournitures et les étapes permettant d’isoler, de cryoconserver et de décongeler des PBMC de haute qualité et hautement viables à partir de cellules sanguines totales adaptées à des applications en aval telles que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des protocoles de traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir du sang entier en parallèle et en même temps que les PBMC sont également décrits. Ce protocole étape par étape facile à suivre, qui utilise la centrifugation par gradient de densité pour isoler les PBMC, est accompagné d’une liste de contrôle des fournitures, de l’équipement et des étapes de préparation. Ce protocole convient aux personnes ayant une expérience préalable des techniques de laboratoire et peut être mis en œuvre dans des laboratoires cliniques ou de recherche. La viabilité cellulaire et le séquençage de l’ARN de haute qualité ont résulté de PBMC collectés par des opérateurs sans expérience préalable en laboratoire de l’utilisation de ce protocole.

Introduction

Ce protocole fait la démonstration d’une méthode et d’un flux de travail accessibles pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang total. Ce protocole s’adresse particulièrement aux techniciens de recherche novices, aux étudiants et au personnel de laboratoire clinique dans le but de faciliter la collecte et la cryoconservation des PBMC sans supposer une formation préalable en techniques de laboratoire.

Ce protocole utilise la centrifugation pour séparer les composants du sang total par densité. Le sang total se compose de quatre composants principaux classés par ordre décroissant de densité : les globules rouges/érythrocytes (~45 % du volume), les globules blancs (<1 % du volume), les plaquettes (<1 % du volume) et le plasma (~55 % du volume)1,2,3,4,5,6. Les globules blancs peuvent être subdivisés en deux catégories en fonction des caractéristiques de leur noyau : rond ou multinucléé⁶. Les PBMC sont définis comme des globules blancs à noyaux ronds et se composent des types de cellules suivants : lymphocytes (lymphocytes T, lymphocytes B, cellules NK), cellules dendritiques et monocytes⁶. Les globules blancs multinucléés comprennent les granulocytes, qui se composent des types de cellules suivants : neutrophiles, basophiles et éosinophiles⁶. Les globules blancs multinucléés sont plus denses que les PBMC⁶. Les densités de chaque composant du sang total sont détaillées dans le tableau 1.

Dans ce protocole, le sang total est collecté dans des tubes de centrifugation à gradient de densité. Ces tubes contiennent un milieu à gradient de densité pré-emballé qui a une densité de 1,077 g/mL. Après la centrifugation, les cellules plus denses, y compris les globules blancs multinucléés et les érythrocytes, sont séparées des PBMC et des plaquettes par le milieu à gradient de densité (Figure 1A)^6,7. La PBMC et la fraction plaquettaire sont ensuite recueillies, lavées et centrifugées pour éliminer les plaquettes. Les PBMC purifiés qui en résultent sont collectés et stockés à -80 °C ou dans de l’azote liquide. Les PBMC cryoconservés peuvent être décongelés de manière viable et directement utilisés dans les analyses en aval ou traités en outre pour isoler des types de cellules constitutives spécifiques.

Ce protocole a été optimisé pour un séquençage d’ARN de haute qualité à partir de PBMC hautement viables. Dans cet article, des PBMC ont été isolés et cryoconservés chez des patients dans une clinique externe. Par la suite, les monocytes ont été isolés des PBMC par FACS et analysés par séquençage de l’ARN. Cependant, le protocole peut être largement adapté à d’autres besoins expérimentaux tels que la culture cellulaire, l’édition de gènes, les études fonctionnelles ex-vivo, les analyses de cellules uniques, le phénotypage par cytométrie en flux ou cytométrie par temps de vol, l’isolement d’ADN/ARN ou de protéines, les lames pour l’immunohistochimie, entre autres 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

En plus de la collecte PBMC à partir de tubes de centrifugation à gradient de densité, ce protocole examine comment collecter le plasma et la couche leucocytaire par centrifugation à l’aide d’un tube EDTA. Après centrifugation, le sang total est séparé en plasma, en érythrocytes et en une fine couche d’interface appelée couche leucocytaire contenant des leucocytes (Figure 1B)⁶. La couche leucocytaire est couramment utilisée pour l’extraction de l’ADN et les analyses génomiques ultérieures^19,20. La couche de plasma contient les composants acellulaires du sang total et peut être utilisée pour les tests de biomarqueurs^21,22.

Protocole

Le protocole d’étude a été approuvé par le programme de protection humaine de l’UCSD et du KUMC et est conforme à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour la participation et la collecte de sang.

1. Traitement et cryoconservation des PBMC

1. La veille du prélèvement sanguin, imprimez la liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 2 , puis préparez et étiquetez en conséquence.
   REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour la collecte de 6 tubes de centrifugation à gradient de densité. Chaque tube produit environ 12 millions de PBMC, dont environ 50 % et 20 % seront respectivement des lymphocytes et des monocytes vivants. Adaptez-vous en conséquence aux besoins expérimentaux. Notez que le nombre absolu de cellules peut différer considérablement entre les patients ou les conditions de traitement.
2. En utilisant la technique de phlébotomie standard, prélever du sang total dans 6 tubes de centrifugation à gradient de densité et 1 tube EDTA jusqu’à ce qu’ils soient remplis, soit environ 6 ml de volume.
   REMARQUE : Si des échantillons provenant de plusieurs patients ou conditions de traitement sont nécessaires, les tubes collectés peuvent être stockés jusqu’à 4 h, puis traités simultanément.
3. Après le prélèvement, centrifugez tous les tubes à 1 800 x g pendant 20 min à température ambiante.
   REMARQUE : Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 1 pour une démonstration du fonctionnement d’une centrifugeuse.
4. Après la centrifugation, ouvrez avec précaution le tube de centrifugation à gradient de densité. À l’aide d’une pipette de transfert, vous pourrez retirer et jeter la couche jaune translucide contenant du plasma. Ne dérangez pas la couche brumeuse de cellules directement au-dessus du milieu à gradient de densité. Péchez par excès de prudence, en laissant l’excès de plasma plutôt que de jeter les PBMC. Répétez l’opération pour tous les tubes.
   REMARQUE : Après centrifugation du tube contenant le milieu à gradient de densité, le plasma et les PBMC seront au-dessus du milieu à gradient de densité ; Les érythrocytes et les granulocytes se déposent au fond. Reportez-vous à la figure 1A pour une visualisation.
5. À l’aide d’une nouvelle pipette de transfert, pipetez doucement le volume restant contenant les cellules et le plasma résiduel dans chaque tube vers le haut et vers le bas plusieurs fois au-dessus du milieu à gradient de densité.
6. Après la remise en suspension, pipetez le contenu du tube remis en suspension dans un tube conique de 50 ml étiqueté. Répétez l’opération pour tous les tubes.
7. Verser la solution 1 (RPMI Medium) dans le tube de 50 mL jusqu’à ce qu’elle atteigne la conduite de 50 mL.
8. Répétez les étapes 1.4 à 1.7 pour chaque patient ou condition de traitement si nécessaire.
   REMARQUE : Assurez-vous que différents échantillons ne sont pas mélangés et utilisez une pipette de transfert neuve pour éviter toute contamination.
9. Centrifugez le tube de 50 mL à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Le protocole de collecte de plasma et de buffy détaillé à la section 2 peut être complété pendant cette période.
10. Jeter autant de surnageant que possible. Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles.
    REMARQUE : Après centrifugation, la pastille contient des PBMC, et le surnageant contient des plaquettes et du plasma résiduel.
11. Verser un tube de 15 mL de la solution 2 (RPMI Medium + 12,5 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol) dans le tube conique de 50 mL contenant la pastille de PBMC. Retournez doucement le tube pour remettre en suspension la pastille de cellule.
12. Aspirer 15 mL de la solution 3 (RPMI Medium + 11,25 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol + 10 % de DMSO) à l’aide d’une pipette de transfert. Ajouter goutte à goutte dans le tube de 50 ml.
    REMARQUE : La solution 3 contient du DMSO, qui est toxique pour les cellules à température ambiante. N’ajoutez pas la solution 3 avant qu’elle ne soit prête à être traitée immédiatement.
13. Retournez doucement le tube 3 fois pour mélanger.
14. Remplissez chaque cryoflacon pré-étiqueté et pré-réfrigéré avec 1 mL de PBMC à l’aide d’une pipette multi-distributions.
    REMARQUE : Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 2 pour une démonstration du fonctionnement d’une pipette à distribution multiple.
15. Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation pré-réfrigéré. Ensuite, placez le récipient dans un congélateur à -80 °C.
16. Répétez les étapes 1.9 à 1.13 pour chaque patient ou condition de traitement si nécessaire.
17. Conservez les cryoflacons à l’intérieur du récipient de congélation pendant au moins 12 h, puis transférez-les dans une boîte de stockage étiquetée à -80 °C.
    REMARQUE : Vous pouvez également transférer les cryoflacons congelés dans de l’azote liquide (<-135 °C) pour un stockage à long terme.

2. Traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir de tubes EDTA

1. Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Après centrifugation, la couche supérieure est constituée de plasma, la couche inférieure contient des érythrocytes et l’interface sera la couche leucocytaire. Voir la figure 1B pour une visualisation.
2. À l’aide d’une pipette de transfert neuve, prélevez autant de plasma que possible sans perturber la couche de leucoty. Ensuite, versez des aliquotes de 0,5 ml dans des cryoflacons pré-étiquetés. Aspirez la couche leucocytaire et transférez-la dans le cryoflacon correctement étiqueté.
   REMARQUE : Une partie du plasma et des érythrocytes peuvent contaminer la collection de couche leucocytaire.
3. Répétez l’étape 2.2 pour chaque patient ou condition de traitement au besoin.
4. Après le prélèvement, conservez les cryoflacons dans un congélateur à -80 °C.
   REMARQUE : Vous pouvez également stocker dans de l’azote liquide (<-135 °C) pour un stockage à long terme.

3. Décongélation des PBMC

1. Un jour avant la décongélation, imprimez une liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 3 , puis préparez et étiquetez en conséquence.
   REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour la décongélation de 1 tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBMC. Chaque tube produit environ 2 millions de PBMC, dont environ 50 % et 20 % seront des lymphocytes et des monocytes vivants, respectivement. Adaptez-vous en conséquence aux besoins expérimentaux. Notez que le nombre absolu de cellules peut différer considérablement entre les patients ou les conditions de traitement.
2. Transférez les PBMC congelés de l’entreposage à l’aide de glace sèche et décongelez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 4 minutes, ou juste avant la dernière décongélation des cristaux de glace.
   REMARQUE : Si vous le souhaitez, une aliquote peut être prélevée pour le comptage des cellules et les mesures de viabilité, comme détaillé à la section 4.
3. Après la décongélation, ajouter 1 mL de la solution 4 (PBS + 2 mM d’EDTA) dans chaque flacon cryogénique. Ensuite, versez le contenu dans un tube pré-étiqueté de 50 ml contenant 10 ml de solution 4 pour chaque tube PBMC décongelé. Tapotez pour éliminer les gouttes résiduelles.
4. Placez la crépine cellulaire sur le tube vide de 50 ml, puis versez la suspension cellulaire à travers la crépine cellulaire.
   REMARQUE : Si nécessaire, tapotez légèrement pour briser la tension superficielle.
5. Centrifuger chaque tube contenant les cellules filtrées à 400 x g pendant 7 min à température ambiante.
6. Après la centrifugation, versez le surnageant contenant du DMSO. Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles.
7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu souhaité adapté aux besoins expérimentaux en aval (p. ex., milieu de culture cellulaire, cocktail d’anticorps de cytométrie en flux, etc.).

4. Comptage et viabilité des cellules

1. Immédiatement après la décongélation des PBMC congelés à l’étape 3.2, pipeter 20 μL de cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez un volume égal de solution de bleu de trypan à 0,4 % et pipetez doucement de haut en bas 3 à 4 fois pour mélanger.
2. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, suivez le protocole du fabricant pour compter les cellules et évaluer la viabilité. Assurez-vous que le facteur de dilution de 2 est pris en compte.
   REMARQUE : Comme décrit ailleurs, un hémocytomètre peut être utilisé comme méthode alternative pour évaluer le nombre et la viabilité des cellules²³.

Résultats

Après la collecte et la cryoconservation des PBMC, la viabilité des PBMC, des monocytes et des lymphocytes décongelés de 56 échantillons uniques a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4 conformément aux instructions du fabricant (figure 2A-F). Une viabilité moyenne ± SD des PBMC, des monocytes et des lymphocytes de 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % et 93 ± 5,6 %, respe...

Discussion

Ce protocole de collecte et de cryoconservation des PBMC a été mis en œuvre avec succès par des personnes avec ou sans formation préalable en laboratoire de recherche. Dans notre application, le FACS et le séquençage de l’ARN de monocytes hautement viables purifiés à partir de PBMC stockés ont permis d’obtenir des séquences de haute qualité.

L’une des principales forces de ce protocole est son accessibilité. La technique présentée dans le ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes