全血からの生存率の高いヒト末梢血単核細胞の単離と凍結保存:初心者向けガイド

要約

このプロトコールは、末梢血単核細胞の収集、保存、融解のためのアクセス可能なガイドを提供し、フローサイトメトリーやRNAシーケンシングなどのダウンストリーム分析やワークフローに適しています。プラズマとバフィーコートのコレクションも実演されます。

要約

末梢血単核細胞(PBMC)は、免疫系とその疾患や病原体に対する応答に関する生物医学研究で一般的に使用されています。この詳細なプロトコルでは、フローサイトメトリーやRNAシーケンシングなどのダウンストリームアプリケーションに適した全血細胞から高品質で生存率の高いPBMCを分離、凍結保存、解凍するための機器、消耗品、および手順について説明します。全血からの血漿およびバフィーコートをPBMCと並行して同時に処理するためのプロトコルについても説明します。密度勾配遠心分離法を利用してPBMCを単離するこのわかりやすいステップバイステップのプロトコルには、消耗品、機器、および調製手順のチェックリストが付属しています。このプロトコルは、実験室技術の経験がある個人に適しており、臨床検査室または研究検査室で実施できます。高品質の細胞生存率とRNAシーケンシングは、このプロトコルを使用した実験室の経験がないオペレーターによって収集されたPBMCから得られました。

概要

このプロトコルは、全血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離するためのアクセス可能な方法とワークフローを示しています。このプロトコルは、特に初心者の研究技術者、学生、臨床検査スタッフを対象としており、実験室技術の事前トレーニングを前提とせずにPBMCの収集と凍結保存を促進することを目的としています。

このプロトコルは、遠心分離を利用して全血の成分を密度で分離します。全血は、密度の小さい順にリストされた4つの主要な成分で構成されています:赤血球/赤血球(体積の~45%)、白血球(体積の<1%)、血小板(体積の<1%)、および血漿(体積の~55%)1,2,3,4,5,6。白血球は、その核の特性に基づいて、丸型または多核型の2つのカテゴリーに細分化できます⁶。PBMCは、丸い核を持つ白血球として定義され、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞)、樹状細胞、および単球^6の細胞タイプで構成されています。多核白血球には、好中球、好塩基球、好酸球⁶の細胞タイプからなる顆粒球が含まれます。多核白血球はPBMCよりも密度が高い⁶。全血の各成分の密度を表1に詳述します。

このプロトコルでは、全血を密度勾配遠心分離チューブに収集します。これらのチューブには、密度が 1.077 g/mL の密度グラジエント培地があらかじめ充填されています。遠心分離後、多核白血球および赤血球を含むより密度の高い細胞は、密度勾配培地によってPBMCおよび血小板から分離されます(図1A)^6,7。次に、PBMCと血小板画分を収集、洗浄、遠心分離して血小板を除去します。得られた精製PBMCは、-80°Cまたは液体窒素で収集および保存されます。凍結保存されたPBMCは、生存可能な解凍を行い、ダウンストリーム分析で直接使用することも、特定の構成細胞タイプを単離するために追加処理することもできます。

このプロトコルは、生存率の高いPBMCからの高品質RNAシーケンシングに最適化されています。この記事では、PBMCを外来診療所の患者から分離し、凍結保存しました。その後、単球をFACSによってPBMCから単離し、RNAシーケンシングを介して分析しました。しかし、このプロトコルは、細胞培養、遺伝子編集、ex-vivo機能研究、シングルセル分析、フローサイトメトリーによる表現型決定、または飛行時間によるサイトメトリー、DNA/RNAまたはタンパク質の単離、免疫組織化学のスライドなど、他の実験ニーズに広く適応させることができます8,9,10,11,12,13,14,15、^16、17、18。

密度勾配遠心分離チューブからのPBMC収集に加えて、このプロトコルでは、EDTAチューブを使用した遠心分離による血漿およびバフィーコートの収集方法を確認します。遠心分離後、全血は血漿、赤血球、および白血球を含むバフィーコートと呼ばれる薄い界面層に分離されます(図1B)⁶。バフィーコートは、DNA抽出およびその後のゲノム解析^{に一般的に使用される19,20}。血漿層は全血の無細胞成分を含み、バイオマーカーアッセイ^21,22に使用することができる。

プロトコル

この研究プロトコルは、UCSDおよびKUMCのHuman Protections Programによって承認され、ヘルシンキ宣言に準拠しています。すべての個人は、参加と採血についてインフォームドコンセントを提供しました。

1. PBMCの作製・凍結保存

1. 採血の1日前に、 表2 に記載されている材料と試薬のチェックリストを印刷し、それに応じて準備してラベルを付けます。
   注:このプロトコルは、6つの密度勾配遠心分離チューブの収集用に設計されました。各チューブからは約1,200万個のPBMCが得られ、そのうち約50%と20%がそれぞれ生きたリンパ球と単球になります。実験的なニーズに合わせて拡張できます。なお、細胞の絶対数は、患者様や治療条件によって大きく異なる場合があります。
2. 標準的な瀉血術を使用して、6本の密度勾配遠心分離チューブと1本のEDTAチューブに全血を、約6mLの容量になるまで集めます。
   注:複数の患者または治療条件からのサンプルが必要な場合、収集されたチューブは最大4時間保存され、その後同時に処理される場合があります。
3. 回収後、すべてのチューブを1,800 x g で室温で20分間遠心分離します。
   注:遠心分離機の操作方法のデモンストレーションについては、 補足ビデオ1 を参照してください。
4. 遠心分離後、密度勾配遠心分離チューブを慎重に開きます。トランスファーピペットを使用して、血漿を含む半透明の黄色の層を除去および廃棄します。密度勾配培地の真上にある細胞のかすんだ層を乱さないでください。PBMCを捨てるのではなく、余分な血漿を残すという注意を怠りません。すべてのチューブで繰り返します。
   注:密度勾配培地を含むチューブを遠心分離した後、血漿とPBMCは密度勾配培地より上になります。赤血球と顆粒球は底に落ち着きます。視覚化については、 図 1A を参照してください。
5. 新しいトランスファーピペットを使用して、各チューブ内の細胞と残留血漿を含む残りの容量を、密度勾配培地の上で緩やかに数倍上下にピペットします。
6. 再懸濁後、再懸濁したチューブの内容物をラベル付きの50mLコニカルチューブにピペットで移します。すべてのチューブに対して繰り返します。
7. 溶液1(RPMI培地)を50 mLチューブに50 mLラインに達するまで注ぎます。
8. 必要に応じて、患者または治療状態ごとに手順1.4から1.7を繰り返します。
   注意: 異なるファイルが混ざっていないことを確認し、汚染を避けるために新しいトランスファーピペットを使用してください。
9. 50 mLチューブを300 x g で室温で10分間遠心分離します。
   注:セクション2で詳述されている血漿およびバフィー収集プロトコルは、この期間中に完了する可能性があります。
10. できるだけ多くの上清を捨てます。必要に応じてタップして、残留液滴を取り除きます。
    注:遠心分離後、ペレットにはPBMCが含まれ、上清には血小板と残留血漿が含まれます。
11. 溶液2(RPMI培地+12.5%ヒト血清アルブミン+1μMフラボピリドール)の15mLチューブをPBMCペレットが入った50mLコニカルチューブに注ぎます。チューブを静かに反転させて、細胞ペレットを再懸濁します。
12. トランスファーピペットを使用して、溶液3(RPMI培地+11.25%ヒト血清アルブミン+1μMフラボピリドール+10%DMSO)15mLを吸引します。50mLチューブに滴下します。
    注:溶液3には、室温で細胞に有毒なDMSOが含まれています。解決策 3 は、すぐに処理する準備ができるまで追加しないでください。
13. チューブを3回静かに反転させて混ぜます。
14. マルチディスペンスピペットを使用して、事前に標識および冷却した各クライオバイアルに1 mLのPBMCを充填します。
    注:マルチディスペンスピペットの操作方法のデモンストレーションについては、 補足ビデオ2 を参照してください。
15. 冷凍バイアルを事前に冷却した冷凍容器に入れます。次に、容器を-80°Cの冷凍庫に移します。
16. 必要に応じて、各患者または治療条件について手順1.9から1.13を繰り返します。
17. クライオバイアルを冷凍容器内に最低12時間保管してから、-80°Cのラベル付き保存ボックスに移します。
    注:あるいは、凍結したクライオバイアルを液体窒素(<-135°C)に移して長期保存します。

2. EDTAチューブからのプラズマおよびバフィーコートの加工

1. 1,800 x g で室温で10分間遠心分離します。
   注:遠心分離後、最上層は血漿で構成され、下層は赤血球を含み、界面はバフィーコートになります。視覚化については、 図 1B を参照してください。
2. 新しいトランスファーピペットを使用して、バフィーコート層を乱さずにできるだけ多くのプラズマを吸い上げます。次に、0.5 mLのアリコートを標識済みクライオバイアルに分注します。バフィーコート層を吸引し、適切に標識されたクライオバイアルに移します。
   注:一部の血漿および赤血球は、バフィーコートコレクションを汚染する可能性があります。
3. 必要に応じて、患者または治療状態ごとに手順2.2を繰り返します。
4. 回収後、クライオバイアルを-80°Cの冷凍庫に保管します。
   注:または、液体窒素(<-135°C)で長期保存してください。

3.PBMCの解凍

1. 解凍の1日前に、 表3 に記載されている材料と試薬のチェックリストを印刷し、それに応じて準備してラベルを貼ってください。
   注:このプロトコルは、1 mLのPBMCを含む1 1.5 mLチューブ1本の解凍用に設計されました。各チューブからは約 200 万個の PBMC が得られ、そのうち約 50% と 20% がそれぞれ生きたリンパ球と単球になります。実験的なニーズに合わせて拡張できます。なお、細胞の絶対数は、患者様や治療条件によって大きく異なる場合があります。
2. 凍結したPBMCをドライアイスを使用して貯蔵庫から移し、37°Cのインキュベーターで4分間、または最後の氷晶が解凍される直前に解凍します。
   注:必要に応じて、セクション4で詳述されているように、細胞カウントおよび生存率測定のためにアリコートを採取することができる。
3. 解凍後、各クライオバイアルに1 mLのSolution 4(PBS + 2 mM EDTA)を加えます。次に、PBMCチューブを解凍するごとに10 mLの溶液4が入った標識済みの50 mLチューブに内容物を注ぎます。タップして残留液滴を取り除きます。
4. 空の50mLチューブにセルストレーナーを置き、セルストレーナーに細胞懸濁液を注ぎます。
   注意: 必要に応じて、軽くたたいて表面張力を壊します。
5. 歪んだ細胞を含む各チューブを400 x g で室温で7分間遠心分離します。
6. 遠心分離後、DMSOを含む上清を注ぎます。必要に応じてタップして、残留液滴を取り除きます。
7. 細胞ペレットを、下流の実験ニーズに適した目的の培地(細胞培養培地、フローサイトメトリー抗体カクテルなど)に再懸濁します。

4. 細胞のカウントと生存率

1. ステップ3.2で凍結PBMCを解凍した直後に、20μLの細胞を1.5mLのチューブにピペットで移します。等量の0.4%トリパンブルー溶液を加え、ピペットで3〜4回静かに上下させて混合します。
2. 自動セルカウンターを使用して、メーカーのプロトコルに従って細胞をカウントし、生存率を評価します。希釈係数 2 が考慮されていることを確認します。
   注:他の場所で述べられているように、血球計算盤は、細胞数および生存率を評価するための代替方法として使用され得る²³。

結果

PBMCの収集と凍結保存に続いて、56のユニークなサンプルからの解凍したPBMC、単球、およびリンパ球の生存率を、製造元の指示に従って表4にリストされている試薬を使用してフローサイトメトリーによって評価しました(図2A-F)。PBMC、単球、およびリンパ球の平均±SD生存率は、それぞれ94 ± 4.0%、98 ± 1.1%、および93 ± 5.6%?...

ディスカッション

PBMCの収集と凍結保存のためのこのプロトコルは、事前の研究室でのトレーニングの有無にかかわらず、個人によって成功裏に実施されています。私たちのアプリケーションでは、保存されたPBMCから精製された生存率の高い単球のFACSおよびRNAシーケンシングにより、高品質のシーケンシングが得られました。

このプロトコルの大きな強みは、そ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes