Выделение и криоконсервация высокожизнеспособных мононуклеарных клеток периферической крови человека из цельной крови: руководство для начинающих

Резюме

Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.

Аннотация

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.

Введение

Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.

В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% объема), лейкоциты (<1% объема), тромбоциты (<1% объема) и плазма (~55% объема)1,2,3,4,5,6. Лейкоциты можно подразделить на две категории в зависимости от характеристик их ядер: круглые или многоядерные⁶. PBMC определяются как белые кровяные клетки с круглыми ядрами и состоят из следующих типов клеток: лимфоциты (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки), дендритные клетки и моноциты⁶. К многоядерным лейкоцитам относятся гранулоциты, которые состоят из следующих типов клеток: нейтрофилы, базофилы и эозинофилы⁶. Многоядерные лейкоциты более плотные, чем PBMC⁶. Плотность каждого компонента цельной крови подробно изложена в таблице 1.

В этом протоколе цельная кровь собирается в центрифугирующие пробирки с градиентом плотности. Эти пробирки содержат предварительно упакованную среду градиента плотности, которая имеет плотность 1,077 г/мл. После центрифугирования более плотные клетки, включая многоядерные лейкоциты и эритроциты, отделяют от PBMC и тромбоцитов средой градиента плотности (рис. 1A)^6,7. Затем PBMC и фракция тромбоцитов собирают, промывают и центрифугируют для удаления тромбоцитов. Полученные очищенные PBMC собираются и хранятся при температуре -80 °C или в жидком азоте. Криоконсервированные PBMC могут быть жизнеспособно разморожены и непосредственно использованы в последующих анализах или дополнительно обработаны для выделения определенных типов составляющих клеток.

Этот протокол был оптимизирован для высококачественного секвенирования РНК из высокожизнеспособных PBMC. В данной статье PBMC были выделены и крионированы, полученные от пациентов в амбулаторной клинике. Впоследствии моноциты были выделены из PBMC с помощью FACS и проанализированы с помощью секвенирования РНК. Тем не менее, протокол может быть широко адаптирован к другим экспериментальным потребностям, таким как культивирование клеток, редактирование генов, функциональные исследования ex-vivo, анализы отдельных клеток, фенотипирование с помощью проточной цитометрии или цитометрии по времени полета, выделение ДНК/РНК или белков, слайды для иммуногистохимии, среди прочего 8,9,10,11,12,13,14,15; 16,17,18.

В дополнение к сбору PBMC из центрифугирующих пробирок с градиентом плотности, в этом протоколе рассматривается, как собирать плазму и охристую оболочку с помощью центрифугирования с использованием пробирки ЭДТА. После центрифугирования цельная кровь разделяется на плазму, эритроциты и тонкий межевой слой, называемый охристой оболочкой, содержащей лейкоциты (рис. 1B)⁶. Охристая шерсть обычно используется для экстракции ДНК и последующих геномных анализов^19,20. Плазменный слой содержит бесклеточные компоненты цельной крови и может быть использован для анализа биомаркеров^21,22.

протокол

Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.

1. Переработка и криоконсервация МПМК

1. За день до забора крови распечатайте контрольный список материалов и реагентов, перечисленных в таблице 2 , и подготовьте и промаркируйте его соответствующим образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для сбора 6 пробирок для центрифугирования с градиентом плотности. Из каждой пробирки получается примерно 12 миллионов PBMC, из которых примерно 50% и 20% будут живыми лимфоцитами и моноцитами соответственно. Масштабируйте в соответствии с экспериментальными потребностями. Обратите внимание, что абсолютное количество клеток может существенно отличаться в зависимости от пациента или условий лечения.
2. Используя стандартную технику флеботомии, соберите цельную кровь в 6 пробирок центрифугирования градиента плотности и 1 пробирку ЭДТА до полного заполнения, примерно 6 мл объема.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуются образцы от нескольких пациентов или условия лечения, собранные пробирки могут храниться до 4 часов, а затем обрабатываться одновременно.
3. После сбора центрифугируйте все пробирки при давлении 1 800 x g в течение 20 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к дополнительному видео 1 для демонстрации работы с центрифугой.
4. После центрифугирования осторожно откройте пробирку для центрифугирования с градиентом плотности. С помощью трансферной пипетки удалите и выбросьте полупрозрачный желтый слой, содержащий плазму. Не тревожьте туманный слой клеток непосредственно над градиентом плотности среды. Будьте осторожны, оставляя избыток плазмы, а не выбрасывая PBMC. Повторите для всех пробирок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования пробирки, содержащей среду с градиентом плотности, плазма и PBMC будут находиться выше среды с градиентом плотности; Эритроциты и гранулоциты осядут на дно. Визуализация приведена на рисунке 1A .
5. С помощью новой трансферной пипетки пипетка осторожно поднимает и опускает оставшийся объем клеток и остаточной плазмы в каждой пробирке вверх и вниз в несколько раз выше градиента плотности.
6. После ресуспендирования пипеткой ресуспендированное содержимое пробирки в коническую пробирку с маркировкой объемом 50 мл. Повторите для всех трубок.
7. Налейте раствор 1 (RPMI Medium) в пробирку объемом 50 мл до тех пор, пока он не достигнет отметки 50 мл.
8. При необходимости повторяйте шаги с 1.4 по 1.7 для каждого пациента или состояния лечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разные образцы не смешиваются, и используйте новую пипетку для переноса, чтобы избежать загрязнения.
9. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при давлении 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол сбора плазмы и баффи, подробно описанный в разделе 2, может быть завершен в течение этого времени.
10. Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости. Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула содержит PBMC, а надосадочная жидкость содержит тромбоциты и остаточную плазму.
11. Налейте 15 мл пробирки Раствора 2 (RPMI Medium + 12,5% сывороточный альбумин человека + 1 мкМ флавопиридол) в 50 мл конической пробирки, содержащей гранулу PBMC. Аккуратно переверните трубку, чтобы повторно суспендировать клеточную гранулу.
12. Аспирируйте 15 мл раствора 3 (среда RPMI + 11,25% альбумин сыворотки крови + 1 мкМ флавопиридол + 10% ДМСО) с помощью переводной пипетки. Добавьте по каплям в тюбик объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 3 содержит ДМСО, который токсичен для клеток при комнатной температуре. Не добавляйте раствор 3 до тех пор, пока он не будет готов к немедленной обработке.
13. Аккуратно переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
14. Наполните каждый предварительно маркированный и предварительно охлажденный криовиал 1 мл PBMC с помощью дозирующей пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительном видео 2 показано, как работать с дозатором с несколькими дозаторами.
15. Поместите криовиалы в предварительно охлажденный контейнер для заморозки. Затем переместите контейнер в морозильную камеру при температуре -80 °C.
16. При необходимости повторите шаги 1.9–1.13 для каждого пациента или состояния лечения.
17. Храните криовиалы в контейнере для заморозки не менее 12 часов, затем переложите их в маркированный ящик для хранения при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы перенесите замороженные криовиалы в жидкий азот (<-135 °C) для длительного хранения.

2. Обработка плазмы и охристого покрытия из пробирок ЭДТА

1. Центрифугируйте при давлении 1 800 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования верхний слой состоит из плазмы, нижний содержит эритроциты, а на границе раздела будет охристая оболочка. Визуализация приведена на рисунке 1B .
2. С помощью новой переводной пипетки наберите как можно больше плазмы, не нарушая охристый слой шерсти. Затем распределите 0,5 мл аликвот в предварительно помеченные криовиалы. Аспирируйте охристый слой шерсти и перенесите его на криовиальный слой с соответствующей маркировкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые виды плазмы и эритроцитов могут загрязнять коллекцию охристой шерсти.
3. При необходимости повторите шаг 2.2 для каждого пациента или условия лечения.
4. После сбора храните криовалиал в морозильной камере при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно хранить в жидком азоте (<-135 °C) для длительного хранения.

3. Размораживание PBMC

1. За день до размораживания распечатайте контрольный список материалов и реагентов, перечисленных в таблице 3 , и подготовьте и промаркируйте его соответствующим образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для размораживания 1 1,5 мл пробирки, содержащей 1 мл PBMC. Из каждой пробирки получается примерно 2 миллиона PBMC, из которых примерно 50% и 20% будут живыми лимфоцитами и моноцитами соответственно. Масштабируйте в соответствии с экспериментальными потребностями. Обратите внимание, что абсолютное количество клеток может существенно отличаться в зависимости от пациента или условий лечения.
2. Замороженные ПМК переложить из хранилища с помощью сухого льда и разморозить в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 минут или непосредственно перед тем, как оттают кристаллы льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно взять аликвоту для подсчета клеток и измерения жизнеспособности, как подробно описано в разделе 4.
3. После размораживания добавьте по 1 мл раствора 4 (PBS + 2 mM EDTA) в каждый криовиал. Затем вылейте содержимое в предварительно маркированную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл раствора 4 на каждую размороженную пробирку PBMC. Нажмите, чтобы удалить остатки капель.
4. Поместите клеточный фильтр на пустую пробирку объемом 50 мл, а затем вылейте клеточную суспензию через клеточный фильтр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости слегка постучите, чтобы нарушить поверхностное натяжение.
5. Центрифугируйте каждую пробирку, содержащую процеженные клетки, при давлении 400 х г в течение 7 мин при комнатной температуре.
6. После центрифугирования вылейте надосадочную жидкость, содержащую ДМСО. Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель.
7. Ресуспендируйте клеточную гранулу в желаемую среду, подходящую для последующих экспериментальных нужд (например, среды для клеточных культур, коктейль антител для проточной цитометрии и т.д.).

4. Подсчет клеток и жизнеспособность

1. Сразу после размораживания замороженных PBMC на шаге 3.2 пипеткой введите 20 мкл клеток в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте равный объем 0,4% раствора Trypan Blue и осторожно перемешайте пипеткой вверх и вниз 3-4 раза.
2. Используя автоматический счетчик клеток, следуйте протоколу производителя для подсчета клеток и оценки жизнеспособности. Убедитесь, что учитывается коэффициент разбавления, равный 2.
   Примечание: Как описано в другом месте, гемоцитометр может быть использован в качестве альтернативного метода оценки количества клеток и жизнеспособности²³.

Результаты

После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей ...

Обсуждение

Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes