Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

Riepilogo

Questo protocollo presenta una guida accessibile per la raccolta, la conservazione e lo scongelamento di cellule mononucleate del sangue periferico adatte per analisi e flussi di lavoro a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono dimostrate anche le collezioni di plasma e buffy coat.

Abstract

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate nella ricerca biomedica sul sistema immunitario e la sua risposta a malattie e agenti patogeni. Questo protocollo dettagliato descrive le apparecchiature, le forniture e i passaggi per l'isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento di PBMC di alta qualità e altamente vitali da cellule di sangue intero, adatte per applicazioni a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono inoltre descritti i protocolli per l'elaborazione del plasma e del buffy coat dal sangue intero in parallelo e in concomitanza con le PBMC. Questo protocollo passo-passo facile da seguire, che utilizza la centrifugazione in gradiente di densità per isolare le PBMC, è accompagnato da una lista di controllo di forniture, attrezzature e fasi di preparazione. Questo protocollo è adatto a persone con qualsiasi esperienza precedente con le tecniche di laboratorio e può essere implementato in laboratori clinici o di ricerca. La vitalità cellulare e il sequenziamento dell'RNA di alta qualità sono il risultato di PBMC raccolti da operatori senza precedenti esperienze di laboratorio nell'utilizzo di questo protocollo.

Introduzione

Questo protocollo dimostra un metodo e un flusso di lavoro accessibili per l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Questo protocollo è rivolto in particolare ai tecnici di ricerca alle prime armi, agli studenti e al personale di laboratorio clinico con l'obiettivo di facilitare la raccolta e la crioconservazione delle PBMC senza presupporre una formazione preliminare nelle tecniche di laboratorio.

Questo protocollo utilizza la centrifugazione per separare i componenti del sangue intero in base alla densità. Il sangue intero è costituito da quattro componenti principali elencati in ordine decrescente di densità: globuli rossi/eritrociti (~45% del volume), globuli bianchi (<1% del volume), piastrine (<1% del volume) e plasma (~55% del volume)1,2,3,4,5,6. I globuli bianchi possono essere suddivisi in due categorie in base alle caratteristiche dei loro nuclei: rotondi o plurinucleati⁶. Le PBMC sono definite come globuli bianchi con nuclei rotondi e sono costituite dai seguenti tipi di cellule: linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), cellule dendritiche e monociti⁶. I globuli bianchi multinucleati includono i granulociti, che consistono nei seguenti tipi di cellule: neutrofili, basofili ed eosinofili⁶. I globuli bianchi multinucleati sono più densi dei PBMC⁶. Le densità di ciascun componente del sangue intero sono dettagliate nella Tabella 1.

In questo protocollo, il sangue intero viene raccolto in provette per centrifugazione a gradiente di densità. Queste provette contengono un terreno di gradiente di densità preconfezionato con una densità di 1,077 g/mL. Dopo la centrifugazione, le cellule più dense, compresi i globuli bianchi multinucleati e gli eritrociti, vengono separate dalle PBMC e dalle piastrine mediante il mezzo del gradiente di densità (Figura 1A)^6,7. La PBMC e la frazione piastrinica vengono quindi raccolte, lavate e centrifugate per rimuovere le piastrine. Le PBMC purificate risultanti vengono raccolte e conservate a -80 °C o in azoto liquido. Le PBMC crioconservate possono essere scongelate in modo vitale e utilizzate direttamente nelle analisi a valle o ulteriormente elaborate per isolare specifici tipi di cellule componenti.

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento di RNA di alta qualità da PBMC altamente vitali. In questo articolo, le PBMC sono state isolate e crioconservate da pazienti in una clinica ambulatoriale. Successivamente, i monociti sono stati isolati dalle PBMC mediante FACS e analizzati tramite sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, il protocollo può essere ampiamente adattato ad altre esigenze sperimentali come la coltura cellulare, l'editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l'isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Oltre alla raccolta di PBMC da provette per centrifugazione a gradiente di densità, questo protocollo esamina come raccogliere il plasma e il buffy coat tramite centrifugazione utilizzando una provetta EDTA. Dopo la centrifugazione, il sangue intero viene separato in plasma, eritrociti e un sottile strato di interfaccia chiamato buffy coat contenente leucociti (Figura 1B)⁶. Il buffy coat è comunemente usato per l'estrazione del DNA e le successive analisi genomiche^19,20. Lo strato plasmatico contiene i componenti privi di cellule del sangue intero e può essere utilizzato per saggi di biomarcatori^21,22.

Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dall'UCSD e dal KUMC Human Protections Program ed è conforme alla Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli individui hanno fornito il consenso informato per la partecipazione e la raccolta del sangue.

1. Elaborazione e crioconservazione delle PBMC

1. Un giorno prima del prelievo di sangue, stampare la lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 2 e preparare ed etichettare di conseguenza.
   NOTA: Questo protocollo è stato progettato per la raccolta di 6 provette per centrifugazione a gradiente di densità. Ogni provetta produce circa 12 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
2. Utilizzando la tecnica standard di flebotomia, raccogliere il sangue intero in 6 provette da centrifugazione a gradiente di densità e 1 provetta EDTA fino al riempimento, circa 6 ml di volume.
   NOTA: Se sono necessari campioni da più pazienti o condizioni di trattamento, le provette raccolte possono essere conservate fino a 4 ore e quindi elaborate contemporaneamente.
3. Dopo la raccolta, centrifugare tutte le provette a 1.800 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 1 per una dimostrazione di come utilizzare una centrifuga.
4. Dopo la centrifugazione, aprire con cautela la provetta per centrifugazione a gradiente di densità. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere ed eliminare lo strato giallo traslucido contenente plasma. Non disturbare lo strato nebuloso di celle direttamente sopra il mezzo del gradiente di densità. Pecca per eccesso di cautela, lasciando il plasma in eccesso piuttosto che scartare le PBMC. Ripetere per tutte le provette.
   NOTA: Dopo la centrifugazione della provetta contenente il mezzo a gradiente di densità, il plasma e le PBMC saranno al di sopra del mezzo a gradiente di densità; Gli eritrociti e i granulociti si depositeranno sul fondo. Fare riferimento alla Figura 1A per una visualizzazione.
5. Con una nuova pipetta di trasferimento, pipettare delicatamente su e giù il volume rimanente contenente le cellule e il plasma residuo in ciascuna provetta più volte al di sopra del mezzo di gradiente di densità.
6. Dopo la risospensione, pipettare il contenuto risospeso della provetta in una provetta conica da 50 mL etichettata. Ripetere per tutte le provette.
7. Versare la soluzione 1 (RPMI Medium) nella provetta da 50 mL fino a raggiungere la linea da 50 mL.
8. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.7 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
   NOTA: Assicurarsi che campioni diversi non siano mescolati e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per evitare contaminazioni.
9. Centrifugare la provetta da 50 mL a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il protocollo di raccolta del plasma e del buffy descritto nella Sezione 2 può essere completato durante questo periodo.
10. Scartare quanto più surnatante possibile. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet contiene PBMC e il surnatante contiene piastrine e plasma residuo.
11. Versare una provetta da 15 mL di Soluzione 2 (terreno RPMI + 12,5% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol) nella provetta conica da 50 mL contenente il pellet di PBMC. Capovolgere delicatamente il tubo per risospendere il pellet della cella.
12. Aspirare 15 mL di soluzione 3 (terreno RPMI + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO) utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere goccia a goccia alla provetta da 50 mL.
    NOTA: La soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente. Non aggiungere la soluzione 3 fino a quando non è pronta per essere immediatamente elaborata.
13. Capovolgere delicatamente il tubo 3 volte per mescolare.
14. Riempire ogni crioviale pre-marcato e pre-raffreddato con 1 mL di PBMC utilizzando una pipetta a dispensazione multipla.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 2 per una dimostrazione di come utilizzare una pipetta a dispensazione multipla.
15. Metti i crioviali all'interno di un contenitore di congelamento pre-raffreddato. Quindi, spostare il contenitore in un congelatore a -80 °C.
16. Ripetere i passaggi da 1.9 a 1.13 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
17. Conservare i crioviali all'interno del contenitore di congelamento per un minimo di 12 ore, quindi trasferirli in una scatola di conservazione etichettata a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, trasferire i crioviali congelati in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

2. Lavorazione di plasma e buffy coat da provette EDTA

1. Centrifugare a 1.800 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, lo strato superiore è costituito da plasma, il fondo contiene eritrociti e l'interfaccia sarà il buffy coat. Vedere la Figura 1B per una visualizzazione.
2. Utilizzando una nuova pipetta di trasferimento, aspirare quanto più plasma possibile senza disturbare lo strato di buffy coat. Quindi, erogare 0,5 mL di aliquote in crioviali premarcati. Aspirare lo strato di buffy coat e trasferirlo nel crioviale opportunamente etichettato.
   NOTA: Alcuni plasma ed eritrociti possono contaminare la collezione di buffy coat.
3. Ripetere il passaggio 2.2 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
4. Dopo la raccolta, conservare i crioviali in un congelatore a -80 °C.
   NOTA: In alternativa, conservare in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

3. Scongelamento delle PBMC

1. Un giorno prima dello scongelamento, stampare una lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 3 e preparare ed etichettare di conseguenza.
   NOTA: Questo protocollo è stato progettato per lo scongelamento di 1 provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBMC. Ogni provetta produce circa 2 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
2. Trasferire le PBMC congelate dal deposito con ghiaccio secco e scongelarle in un'incubatrice a 37 °C per 4 minuti, o appena prima dello scongelamento dell'ultimo cristallo di ghiaccio.
   NOTA: Se lo si desidera, è possibile prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule e le misure di vitalità, come descritto nella Sezione 4.
3. Dopo lo scongelamento, aggiungere 1 mL di Soluzione 4 (PBS + 2 mM EDTA) a ciascun crioviale. Quindi, versare il contenuto in una provetta da 50 ml pre-marcata contenente 10 ml di soluzione 4 per ogni provetta PBMC scongelata. Tocca per rimuovere le gocce residue.
4. Posizionare il filtro cellulare sulla provetta vuota da 50 mL, quindi versare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare.
   NOTA: Se necessario, picchiettare leggermente per interrompere la tensione superficiale.
5. Centrifugare ogni provetta contenente le celle filtrate a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
6. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante contenente DMSO. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
7. Risospendere il pellet cellulare nel terreno desiderato appropriato per le esigenze sperimentali a valle (ad es. terreni di coltura cellulare, cocktail di anticorpi per citometria a flusso, ecc.).

4. Conteggio e vitalità delle cellule

1. Immediatamente dopo lo scongelamento delle PBMC congelate nella fase 3.2, pipettare 20 μL di cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% e pipettare delicatamente su e giù 3-4 volte per mescolare.
2. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, seguire il protocollo del produttore per contare le cellule e valutarne la vitalità. Assicurarsi che il fattore di diluizione di 2 sia preso in considerazione.
   NOTA: Come descritto altrove, un emocitometro può essere utilizzato come metodo alternativo per valutare la conta e la vitalità cellulare²³.

Risultati

Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2A-F). È stata raggiunta una vitalità media ± SD di PBMC, monociti e linfociti rispettivamente del 94 ± del 4,0%, del 98 ± dell'1,1% e del 93 ± del 5,6% (...

Discussione

Questo protocollo per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC è stato implementato con successo da individui con e senza una precedente formazione di laboratorio di ricerca. Nella nostra applicazione, il sequenziamento FACS e RNA di monociti altamente vitali purificati da PBMC conservati ha portato a sequenze di alta qualità.

Uno dei principali punti di forza di questo protocollo è la sua accessibilità. La tecnica presentata nel protocollo utilizza t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes