Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen zugänglichen Leitfaden für die Sammlung, Lagerung und das Auftauen von mononukleären Zellen des peripheren Blutes dar, der für nachgelagerte Analysen und Arbeitsabläufe wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet ist. Plasma- und Buffy-Coat-Sammlungen werden ebenfalls vorgeführt.

Zusammenfassung

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden häufig in der biomedizinischen Forschung zum Immunsystem und seiner Reaktion auf Krankheiten und Krankheitserreger eingesetzt. Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Ausrüstung, das Zubehör und die Schritte für die Isolierung, Kryokonservierung und das Auftauen hochwertiger und hochlebensfähiger PBMCs aus Vollblutzellen, die für Downstream-Anwendungen wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet sind. Protokolle für die parallele und gleichzeitige Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus dem Vollblut mit PBMCs werden ebenfalls beschrieben. Dieses leicht verständliche Schritt-für-Schritt-Protokoll, bei dem die Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs verwendet wird, wird von einer Checkliste mit Verbrauchsmaterialien, Geräten und Vorbereitungsschritten begleitet. Dieses Protokoll ist für Personen geeignet, die bereits Erfahrung mit Labortechniken haben, und kann in klinischen oder Forschungslabors implementiert werden. Qualitativ hochwertige Zellviabilität und RNA-Sequenzierung resultierten aus PBMCs, die von Bedienern ohne vorherige Laborerfahrung mit diesem Protokoll entnommen wurden.

Einleitung

Dieses Protokoll demonstriert eine zugängliche Methode und einen Arbeitsablauf für die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Vollblut. Dieses Protokoll richtet sich insbesondere an unerfahrene Forschungstechniker, Studenten und klinisches Laborpersonal mit dem Ziel, die Entnahme und Kryokonservierung von PBMCs zu erleichtern, ohne eine vorherige Ausbildung in Labortechniken zu erfordern.

Bei diesem Protokoll wird eine Zentrifugation verwendet, um die Bestandteile des Vollbluts nach Dichte zu trennen. Vollblut besteht aus vier Hauptkomponenten, die in der Reihenfolge abnehmender Dichte aufgeführt sind: rote Blutkörperchen/Erythrozyten (~45 % des Volumens), weiße Blutkörperchen (<1 % des Volumens), Blutplättchen (<1 % des Volumens) und Plasma (~55 % des Volumens)1,2,3,4,5,6. Weiße Blutkörperchen können aufgrund ihrer Zellkerneigenschaften in zwei Kategorien unterteilt werden: rund oder mehrkernig⁶. PBMCs sind definiert als weiße Blutkörperchen mit runden Kernen und bestehen aus den folgenden Zelltypen: Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen), dendritische Zellen und Monozyten⁶. Zu den mehrkernigen weißen Blutkörperchen gehören Granulozyten, die aus den folgenden Zelltypen bestehen: Neutrophile, Basophile und Eosinophile⁶. Mehrkernige weiße Blutkörperchen sind dichter als PBMCs⁶. Die Dichten der einzelnen Bestandteile des Vollblutes sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Bei diesem Protokoll wird Vollblut in Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen gesammelt. Diese Röhrchen enthalten ein vorgepacktes Dichtegradientenmedium mit einer Dichte von 1,077 g/ml. Nach der Zentrifugation werden dichtere Zellen, einschließlich mehrkerniger weißer Blutkörperchen und Erythrozyten, durch das Dichtegradientenmedium von PBMCs und Blutplättchen getrennt (Abbildung 1A)^6,7. Die PBMC- und Thrombozytenfraktion wird dann gesammelt, gewaschen und zentrifugiert, um Blutplättchen zu entfernen. Die daraus resultierenden gereinigten PBMCs werden gesammelt und bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Kryokonservierte PBMCs können auftaut und direkt in nachgelagerten Analysen verwendet oder zusätzlich verarbeitet werden, um bestimmte Komponentenzelltypen zu isolieren.

Dieses Protokoll wurde für die qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen PBMCs optimiert. In diesem Artikel wurden PBMCs von Patienten in einer Ambulanz isoliert und kryokonserviert. Anschließend wurden Monozyten mittels FACS aus PBMCs isoliert und mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Das Protokoll kann jedoch weitgehend an andere experimentelle Bedürfnisse angepasst werden, wie z.B. Zellkultur, Geneditierung, ex-vivo-Funktionsstudien, Einzelzellanalysen, Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder Zytometrie nach Flugzeit, Isolierung von DNA/RNA oder Proteinen, Objektträger für die Immunhistochemie, u.a. ^{8,9,10,11,12,13,14,15}, 16,17,18.

Zusätzlich zur PBMC-Entnahme aus Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen wird in diesem Protokoll erläutert, wie Plasma und Buffy Coat durch Zentrifugation mit einem EDTA-Röhrchen gesammelt werden. Nach der Zentrifugation wird das Vollblut in Plasma, Erythrozyten und eine dünne Grenzschicht, die als Buffy Coat bezeichnet wird und Leukozyten enthält, getrennt (Abbildung 1B)⁶. Der Buffy Coat wird häufig für die DNA-Extraktion und nachfolgende genomische Analysen verwendet^19,20. Die Plasmaschicht enthält die zellfreien Bestandteile des Vollblutes und kann für Biomarker-Assays verwendet werden^21,22.

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der UCSD und dem KUMC Human Protections Program genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Personen gaben eine Einverständniserklärung zur Teilnahme und Blutentnahme.

1. Verarbeitung und Kryokonservierung von PBMCs

1. Drucken Sie einen Tag vor der Blutentnahme die Checkliste der in Tabelle 2 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Entnahme von 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen entwickelt. Jedes Röhrchen liefert etwa 12 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann.
2. Sammeln Sie mit der Standard-Phlebotomietechnik Vollblut in 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen und 1 EDTA-Röhrchen, bis es gefüllt ist, ca. 6 ml Volumen.
   HINWEIS: Wenn Proben von mehreren Patienten oder Behandlungsbedingungen erforderlich sind, können die entnommenen Röhrchen bis zu 4 Stunden gelagert und dann gleichzeitig verarbeitet werden.
3. Nach der Entnahme zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 1.800 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Im ergänzenden Video 1 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Zentrifuge.
4. Öffnen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die durchscheinende gelbe Schicht, die das Plasma enthält, zu entfernen und zu entsorgen. Stören Sie nicht die trübe Zellschicht direkt über dem Dichtegradientenmedium. Gehen Sie auf Nummer sicher und lassen Sie überschüssiges Plasma, anstatt PBMCs zu entsorgen. Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen.
   HINWEIS: Nach der Zentrifugation des Röhrchens, das das Dichtegradientenmedium enthält, befinden sich Plasma und PBMCs über dem Dichtegradientenmedium; Erythrozyten und Granulozyten setzen sich am Boden ab. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1A .
5. Pipettieren Sie mit einer neuen Transferpipette das verbleibende Volumen, das die Zellen und das Restplasma in jedem Röhrchen enthält, vorsichtig mehrere Male über dem Dichtegradientenmedium auf und ab.
6. Pipettieren Sie nach der Resuspension den resuspendierten Inhalt des Röhrchens in ein beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben.
7. Gießen Sie Lösung 1 (RPMI Medium) in das 50-ml-Röhrchen, bis es die 50-ml-Linie erreicht.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.7 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass verschiedene Proben nicht vermischt werden, und verwenden Sie eine neue Transferpipette, um eine Kontamination zu vermeiden.
9. Zentrifugieren Sie das 50 mL Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Das in Abschnitt 2 beschriebene Plasma- und Buffy-Entnahmeprotokoll kann während dieser Zeit abgeschlossen werden.
10. Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation enthält das Pellet PBMCs, und der Überstand enthält Blutplättchen und Restplasma.
11. Gießen Sie ein 15-ml-Röhrchen Lösung 2 (RPMI-Medium + 12,5 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol) in das konische 50-ml-Röhrchen, das das PBMC-Pellet enthält. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Zellpellet wieder zu resuspendieren.
12. Aspirieren Sie 15 ml Lösung 3 (RPMI-Medium + 11,25 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol + 10 % DMSO) mit einer Transferpipette. Geben Sie tropfenweise in das 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Lösung 3 enthält DMSO, das bei Raumtemperatur für Zellen giftig ist. Fügen Sie Lösung 3 erst hinzu, wenn sie sofort verarbeitet werden kann.
13. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 3 Mal um, um es zu mischen.
14. Füllen Sie jedes vormarkierte und vorgekühlte Kryofläschchen mit 1 ml PBMC mit einer Multi-Dispense-Pipette.
    HINWEIS: Im ergänzenden Video 2 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Multidispense-Pipette.
15. Stellen Sie die Kryoröhrchen in einen vorgekühlten Gefrierbehälter. Stellen Sie den Behälter dann in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
16. Wiederholen Sie die Schritte 1.9 bis 1.13 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
17. Bewahren Sie die Kryofläschchen mindestens 12 Stunden lang im Gefrierbehälter auf und geben Sie sie dann bei -80 °C in eine beschriftete Aufbewahrungsbox.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die gefrorenen Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff (<-135 °C) umfüllen.

2. Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus EDTA-Röhren

1. Zentrifugieren Sie bei 1.800 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Nach der Zentrifugation besteht die oberste Schicht aus Plasma, die untere enthält Erythrozyten und die Grenzfläche ist der Buffy Coat. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1B .
2. Mit einer neuen Transferpipette wird so viel Plasma wie möglich angesaugt, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören. Geben Sie dann 0,5 ml-Aliquots in vormarkierte Kryoröhrchen ab. Aspirieren Sie die Buffy-Coat-Schicht und übertragen Sie sie in das entsprechend gekennzeichnete Kryofläschchen.
   HINWEIS: Einige Plasma- und Erythrozyten können die Buffy-Coat-Sammlung kontaminieren.
3. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
4. Lagern Sie die Kryofläschchen nach der Entnahme in einem -80 °C heißen Gefrierschrank.
   HINWEIS: Alternativ zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff (<-135 °C) lagern.

3. Auftauen von PBMCs

1. Drucken Sie einen Tag vor dem Auftauen eine Checkliste mit den in Tabelle 3 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für das Auftauen von 1 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PBMC entwickelt. Jedes Röhrchen ergibt etwa 2 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann.
2. Gefrorene PBMCs mit Trockeneis aus dem Lager überführen und in einem 37 °C heißen Inkubator für 4 Minuten oder kurz vor dem letzten Auftauen des Eiskristalls auftauen.
   HINWEIS: Falls gewünscht, kann ein Aliquot für Zellzählungs- und Viabilitätsmessungen entnommen werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
3. Nach dem Auftauen 1 ml Lösung 4 (PBS + 2 mM EDTA) in jedes Kryofläschchen geben. Gießen Sie dann den Inhalt in ein vorbeschriftetes 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Lösung 4 für jedes aufgetaute PBMC-Röhrchen. Tippen Sie, um Tropfenreste zu entfernen.
4. Legen Sie das Zellsieb auf das leere 50-ml-Röhrchen und gießen Sie dann die Zellsuspension durch das Zellsieb.
   HINWEIS: Tippen Sie bei Bedarf leicht, um die Oberflächenspannung zu brechen.
5. Jedes Röhrchen mit den passierten Zellen wird 7 min lang bei Raumtemperatur bei 400 x g zentrifugiert.
6. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren den DMSO-haltigen Überstand aus. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in dem gewünschten Medium, das für nachgelagerte experimentelle Anforderungen geeignet ist (z. B. Zellkulturmedien, Durchflusszytometrie, Antikörpercocktail usw.).

4. Zellzählung und Lebensfähigkeit

1. Unmittelbar nach dem Auftauen von gefrorenen PBMCs in Schritt 3.2 pipettieren Sie 20 μl Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Lösung hinzu und pipettieren Sie zum Mischen vorsichtig auf und ab.
2. Befolgen Sie mit einem automatisierten Zellzähler das Protokoll des Herstellers, um Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass der Verdünnungsfaktor von 2 berücksichtigt wird.
   HINWEIS: Wie an anderer Stelle beschrieben, kann ein Hämozytometer als alternative Methode zur Beurteilung der Zellzahl und -viabilität verwendet werden²³.

Ergebnisse

Nach der PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde die Lebensfähigkeit von aufgetauten PBMCs, Monozyten und Lymphozyten aus 56 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Reagenzien, die in Tabelle 4 aufgeführt sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2A-F) bewertet. Es wurde eine mittlere ± SD-Viabilität von PBMCs, Monozyten und Lymphozyten von 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % bzw. 93 ...

Diskussion

Dieses Protokoll für die PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde von Personen mit und ohne vorherige Laborausbildung erfolgreich umgesetzt. In unserer Anwendung führten die FACS- und RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen Monozyten, die aus gelagerten PBMCs gereinigt wurden, zu qualitativ hochwertigen Sequenzen.

Eine große Stärke dieses Protokolls ist seine Zugänglichkeit. Bei der im Protokoll vorgestellten Technik werden Röhrchen verwendet, die mit ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes