DNA 条形码在药用植物鉴定中的应用

摘要

本方案描述了使用 DNA 条形码技术来鉴定植物性药材和药用植物 Angelica sinensis （Oliv.）Diels 被确定为一个例子。

摘要

药用植物是全球的宝贵资源，在世界范围内用于维持健康和治疗疾病;然而，掺假的存在阻碍了它们的发展。DNA 条形码是一种通过标准 DNA 区域进行物种鉴定的技术，有助于快速准确地鉴定传统药用植物。DNA 条形码的过程包括六个基本步骤：1） 处理药用植物，2） 使用离心柱法从药用植物中提取高质量的总 DNA，3） 用植物的通用引物扩增靶 DNA 区域内部转录间隔 2 （ITS2） 并进行 Sanger 测序，4） 剪接和比对序列以获得靶序列， 5） 将条形码序列与条形码库匹配以进行鉴定，6） 对齐序列，比较种内和种间变异，构建系统发育邻接树。如结果所示，通用引物可以扩增目标区域。基本局部对齐搜索工具 （BLAST） 显示鉴定的百分比为 100%，邻域连接树表明剪接序列与 A. sinensis OR879715.1 分支聚集，分支支持值为 100。该方案为应用 DNA 条形码技术作为鉴定药用植物和掺杂物的有效方法提供了参考。

引言

药用植物具有广泛的药理作用，是治疗和预防疾病的重要物质。草药和医药产品中药用植物的市场需求巨大，并且仍在增长。随着药用植物市场的不断壮大，掺假问题阻碍了药用植物的发展。目前，药用植物掺假的原因如下： 1） 药用植物的相似形态使其难以识别和正确使用它们 ^1,2,3,4,5， 2） 对药用植物的需求不断增加，导致市场供应不足 ^6,7，3） 药用植物价格昂贵且价格波动，使用廉价草药而不是具有经济价值的材料导致掺假和市场暴利 ^8,9。为了解决正确识别和使用药用植物的问题，需要一种技术，使非专业人士也能识别来源¹⁰。

仅凭外观和气味正确识别和使用药用植物是有局限性^{的 11}.为了更准确地鉴定和质量控制，采用了物理化学方法¹².例如，薄层色谱法 （TLC） 是一种鉴定草药的快速方法，已被纳入中国药典。然而，它需要参考标准来识别植物¹³.高效液相色谱 （HPLC） 可以进行定性和定量测试，使其适用于药品质量测试。但是，这种仪器价格昂贵，并且需要专业知识才能操作 ^14,15。DNA 条形码技术是一种快速准确的物种鉴定技术，通过使用稳定的 DNA 序列来区分具有相似形态的植物来鉴定物种。Hebert 等人提出了 DNA 条形码技术来识别物种，该技术使用基因组内公认的且相对较短的 DNA 序列^16，Chen 等人提出 ITS2 作为药用植物分子鉴定的通用序列，鉴定了 6600 多种植物，发现了很高的鉴定能力¹⁷。基于 ITS2 和叶绿体基因片段的药用植物研究表明，在物种水平上区分物种的能力，可应用于资源保护、市场监管和国际贸易领域 17,18,19。DNA 条形码的应用可以克服传统鉴定方法的局限性，有助于确保药用植物的质量和安全，防止资源滥用和混淆²⁰。事实证明，它有益于研究药用植物，以可持续的方式支持草药行业的发展，并保证消费者使用正确的药物 21,22,23,24。

该论文以 A. sinensis 为例概述了如何应用 DNA 条形码来识别药用植物的方案。DNA 条形码利用生物体 DNA 中的一个或多个标准化短遗传标记来识别它属于特定物种。目前鉴定药用植物的方法有一定的局限性。传统的形态学鉴定在很大程度上依赖于专家的丰富经验，这可能会受到人为因素的影响，而化学鉴定则容易出现关键化合物掺假等问题。相比之下，DNA 条形码提供了一种更准确的物种鉴定方法，具有速度、高重现性和稳定性等优势。此外，该技术可以通过互联网和信息平台集中管理和共享现有物种序列数据，显著提高物种识别的效率和可靠性^11,12。由于它们的形态和药用部分相似，A. sinensis 经常与其他物种混淆，并经常在市场上被误用或故意替代²⁵。Yang 等人使用 DNA 条形码鉴定了异常 A. anomala，将其与假药区分开^{来 26}。Yuan 等人收集了 23 种当归，并使用 DNA 条形码来区分各种物种²⁷。通过遵循本协议中描述的程序，用户将能够验证从预处理到最终将条形码序列与条形码数据库匹配的植物性药材（图 1）。

研究方案

1. 样品制备

1. 本研究以甘肃省闽县海拔 2800 m 海拔 2800 m 的 2 年生 中华曲霉 为试验材料。从中选择三种以上的植物进行实验。首先用消毒水冲洗根部，然后用酒精喷雾器或酒精棉签清洁它们，以防止可能影响实验结果准确性的污染。使用消毒的手术刀将根切成小于 5 毫米的块，并混合以供进一步分析。（图 2）。
   注意：或者，将根部放入液氮中使其变脆，使其更容易折断。根据药用植物的形状、硬度和其他特性，使用仪器来处理它们。
2. 准备三管实验样品用于平行实验。将每个样品标记为 AS-1、AS-2 和 AS-3。取约 100 mg 新鲜组织或 20 mg 干重组织（风干），放入 2 mL 离心管中。
3. 将两个 5 mm 不锈钢珠子放入 2 mL 离心管中。将试管转移到以 60 Hz 运行时间 60 秒的高通量组织研磨机中。

2 从样品中提取 DNA

注：本研究使用基于 CTAB 方法的植物基因组 DNA 提取试剂盒。DNA 提取按照说明手册进行，并进行了一些修改，包括添加独特的核分离缓冲液 （NIB）。该方案首先从组织中分离污染物，然后添加初始细胞核分离步骤^28、29、30，从而提高了 DNA 纯度。

1. 加入 800 μL 预冷的 NIB，将样品放在涡旋混合器上，振动 5 分钟。
2. 置于离心机中，以 13,780 x g 的速度处理 10 分钟。去除上清液。
3. 重复步骤 2.1-2.2 再进行 3 轮。
   注意：NIB 提取更高质量的 DNA，其制备物包含一些必须在通风橱中处理的危险化学物质，使新手更难处理。但是，此步骤不是必需的。用户可以选择遵循此建议或跳过这些步骤。其详细表述见 表 1。
4. 加入 600 μL 缓冲液 P1 和 5 μL RNase A （10 mg/mL）。将样品放在涡旋混合器上并涡旋混合。将样品在 65 °C 的水浴中孵育 1.5 小时，在孵育过程中将试管倒置 2 次-3 次。
5. 加入 200 μL 缓冲液 P2，充分混合，置于冰上 15 分钟，然后以 13,780 x g 离心 10 分钟。
6. 小心地将上清液吸出到过滤柱 AF 上，以 13,780 x g 离心 2 分钟，然后将收集管中收集的下层滤液转移到新的 1.5 mL 离心管中。
7. 计算续滤液的体积，加入 1.5 倍体积的 P3，立即振摇，得到混合溶液。
8. 将 650 μL 制备的混合物添加到吸附柱吸附柱 （AC） 中并孵育 5 分钟，然后以 13,780 x g 离心 30-60 秒。
9. 将步骤 2.8 得到的滤液再次加入 AC 中，离心，弃去废液。对步骤 2.7 中剩余的混合溶液重复该过程。
10. 加入 600 μL 冲洗液 WB，以 13,780 x g 离心 30 秒，弃去废液，然后重复该过程 1 次。
11. 将色谱柱 AC 放回空收集管中，以 13,780 x g 离心 2 分钟，然后在室温下放置以去除残留的乙醇。
12. 取吸附剂色谱柱 AC 并将其置于干净的 1.5 mL 离心管中。将 45 μL 无菌去离子水 （ddH₂O） 添加到已加热至 65 °C 的吸附膜中间。 在室温下放置 5 分钟。以 13,780 x g 离心 2 分钟。
13. 将所得溶液加回色谱柱中，并在室温下以 13,780 x g 离心 2 分钟。
14. 收集过滤的解决方案。使用分光光度计测定 DNA 浓度;OD260 代表核酸的吸光度。使用以下标准进行 DNA 质量测定标准：OD260/OD280=1.80-2.00，正常范围;OD260/OD280>2.00;存在大量 RNA 污染;OD260/OD280<1.80，有蛋白质、酚类和其他污染物。

3 靶标片段扩增和检测

注：根据植物建议的 DNA 条形码区域选择合适的扩增引物;反应条件如 表 2 所示。

1. 设置与引物扩增相对应的反应条件。使用 0.2 mL 离心管，其中填充有 9.5 μL ddH₂O、12.5 μL 2x PCR 预混液和 1 μL 正向引物、反向引物和模板 DNA，总体积为 25 μL。制备阴性对照，用水替换模板。
2. 加入 20 mL 1x Tris 乙酸-EDTA （TEA） 缓冲液和 0.2 g 琼脂糖加热并制备 1% 琼脂糖凝胶，然后加入 2 μL 核酸凝胶染色剂 （10,000x） 并充分混合。将混合物倒入凝胶灌注盘中，使其凝固以获得琼脂糖凝胶。向凝胶中加入 3 μL PCR 产物和 2 μL 5000 bp 的 DNA 标记物。
3. 将电压设置为 120 V，电流为 400 mA，然后电泳 40 分钟。使用多功能凝胶图像分析系统查看凝胶并检查结果。

4. 数据收集和分析

注意：有各种各样的序列组装和分析软件;我们使用密码子代码 Aligner V11.0.1 和 MEGA11 作为示例进行说明。

1. 使用对准器打开测序文件以观察峰图并拼接双向测序峰图文件。
   1. 选择 Create a New Project（创建新项目 ），然后单击 OK（确定 ）进入软件首页。在 File 菜单下选择 Add Samples ，选择要作为序列追踪格式处理 的文件 ，然后将其作为导入的文件直接导入到软件中 Unassembled Samples.
   2. 选择 Contig，然后在该部分中选择 Advanced Assembly，然后选择 Assemble in Groups （按组组装）。首次使用的用户在选择 Assemble in Groups 后，将看到此对话框：Choose Define names。根据文件名修改 Define sample name 部分，然后单击 Assemble。将显示对齐的序列。
   3. 根据基于隐马尔可夫模型 （HMM） 的模型分析检索完整的 ITS2 序列。使用 5.8s （CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA） 和 28s （CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC） 序列³¹ 从头开始搜索对齐序列，以删除 5.8s 和 28s 区域。
   4. 选择 Go，然后在该部分中选择 Search Sequence 并单击 OK 以获取匹配的序列。选择 Contig，在部分选择 Delete ，去除 5.8s 和 28s 区域以及低质量序列，然后软件将输出拼接序列进行匹配。
2. 使用从三个平行实验步骤中获得的剪接序列进行鉴定，使用美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 的核苷酸数据库选择 BLAST 搜索，并在全球药典基因组数据库 （GPGD） 数据库中选择相应的物种鉴定工具和特异性引物 ITS2。
   注：NCBI³² 和 GPGD³³ 包括药用植物和动物的核苷酸序列，它们被公认为权威数据库。它们的主要鉴定方法是基于序列比较³⁴ （BLAST） 的方法。同一性结果的百分比同一性用于确定相似度最高的物种是否为目标属。
3. 使用 MEGA11 进行序列比对，分析和比较种内和种间序列变异，并构建系统发育邻接树。
   1. 从 NCBI 下载三种 Angelica 和一种 Peucedanum praeruptorum 的序列作为外群。将这些序列与获得的结果序列一起分析。
   2. 单击 文件（File），选择 打开文件/会话（Open a File/Session ） 以导入文件，然后会出现一个对话框。选择 Align > DNA， 然后选择 Align by ClustalW 进行序列比较。在 Data 中选择 Phylogenetic Analysis （系统发育分析 ），然后返回到主页。单击 PHYLOGENY 中的 Construct/Test Neighbor-Joining Tree 。该软件将生成系统发育树。

结果

样品 DNA 质量

OD 260 / OD 280吸光度比的范围为1.80-1.84。用分光光度计测量的每个样品的 DNA 量大于 100 ng/μL（表 3），表明样品 DNA 提取质量良好。这表明样品在提取过程中没有被蛋白质、RNA 或试剂污染，并且质量好，适合用于下游 PCR 扩增。

PCR 分析

对 3 个平行实验样品的 ...

讨论

分子鉴定技术比传统的鉴定方法更容易学习和掌握。它克服了传统药草鉴定的局限性，因为它不受植物生长阶段的影响，也不依赖于主观判断或专业知识的积累³⁵。由于其相似的形态和药用部分，其他物种与 A. sinensis 混淆，但通过使用 DNA 条形码，可以明确识别^{它 36}。

该协议中的关键步骤涉及几个关键考虑?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.