Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der DNA-Barcoding-Technologie zur Authentifizierung von pflanzlichen medizinischen Materialien und der Heilpflanze Angelica sinensis (Oliv.) Als Beispiel wurde Diels genannt.

Zusammenfassung

Heilpflanzen sind weltweit wertvolle Ressourcen und werden weltweit zur Erhaltung der Gesundheit und zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt. Das Vorhandensein von Verfälschungen behindert jedoch ihre Entwicklung. DNA-Barcoding, eine Technik zur Artidentifizierung anhand von Standard-DNA-Regionen, ermöglicht eine schnelle und genaue Identifizierung traditioneller Heilpflanzen. Der Prozess des DNA-Barcoding umfasst sechs grundlegende Schritte: 1) Verarbeitung der Heilpflanzen, 2) Extraktion hochwertiger Gesamt-DNA aus den Heilpflanzen mit der Zentrifugalsäulenmethode, 3) Amplifikation des internen transkribierten Spacers 2 der Ziel-DNA-Region (ITS2) mit universellen Pflanzenprimern und Durchführung der Sanger-Sequenzierung, 4) Spleißen und Ausrichten der Sequenz, um die Zielsequenz zu erhalten, 5) Abgleich der Barcode-Sequenz mit der Barcode-Bibliothek zur Identifizierung, 6) Ausrichtung der Sequenz, Vergleich intraspezifischer und interspezifischer Variation, Konstruktion eines phylogenetischen Nachbar-Joining-Baums. Wie die Ergebnisse zeigen, kann der universelle Primer die Zielregion amplifizieren. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) zeigt, dass der identifizierte Prozentsatz 100 % betrug, und der Nachbarverbindungsbaum zeigt, dass die Spleißsequenzen mit der A . sinensis OR879715.1-Klade gruppiert wurden und der Wert der Kladestütze 100 beträgt. Dieses Protokoll bietet eine Referenz für die Anwendung der DNA-Barcoding-Technologie als effektive Methode zur Identifizierung von Heilpflanzen und Verfälschungsmitteln.

Einleitung

Heilpflanzen haben ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen und sind wichtige Substanzen für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten. Die Marktnachfrage nach Heilpflanzen in pflanzlichen Arzneimitteln und pharmazeutischen Produkten ist enorm und wächst weiter. Mit dem wachsenden Markt für Heilpflanzen hat das Problem der Verfälschung die Entwicklung von Heilpflanzen behindert. Derzeit leidet die Verfälschung von Heilpflanzen unter diesen Gründen: 1) Die ähnliche Morphologie von Heilpflanzen erschwert es, sie richtig zu identifizieren und zu verwenden 1,2,3,4,5, 2) Die steigende Nachfrage nach Heilpflanzen hat zu einem unzureichenden Angebot auf dem Markt geführt ^6,7, 3) Heilpflanzen sind teuer und haben schwankende Preise, und die Verwendung von billigen Kräutern anstelle von wirtschaftlich wertvollen Materialien hat zu Verfälschungen und Marktgewinngier geführt ^8,9. Um die Probleme der richtigen Identifizierung und Verwendung von Heilpflanzen zu lösen, besteht ein Bedarf an einer Technologie, die es Laien ermöglicht, die Quelle^{zu identifizieren 10}.

Es gibt Einschränkungen bei der korrekten Identifizierung und Verwendung von Heilpflanzen allein anhand des Aussehens und des Geruchs¹¹. Für eine genauere Identifizierung und Qualitätskontrolle werden physikalisch-chemische Methoden eingesetzt¹². Die Dünnschichtchromatographie (DC) zum Beispiel ist eine schnelle Methode zur Identifizierung von Heilkräutern und wurde in das chinesische Arzneibuch aufgenommen. Dennoch sind Referenzstandards erforderlich, um die Pflanzen zu identifizieren¹³. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann sowohl qualitative als auch quantitative Tests durchführen und eignet sich daher für die Qualitätsprüfung von Arzneimitteln. Dieses Instrument ist jedoch teuer und erfordert spezielle Kenntnisse, um es zu bedienen^14,15. Die DNA-Barcoding-Technologie ist eine schnelle und genaue Technologie zur Identifizierung von Arten, die Arten anhand stabiler DNA-Sequenzen identifiziert, um zwischen Pflanzen mit ähnlicher Morphologie zu unterscheiden. Hebert et al. schlugen eine DNA-Barcoding-Technologie zur Identifizierung von Arten vor, die eine anerkannte und relativ kurze DNA-Sequenz innerhalb des Genoms verwendet¹⁶, Chen et al. schlugen ITS2 als universelle Sequenz für die molekulare Identifizierung von Heilpflanzen vor und identifizierten mehr als 6600 Pflanzen und fanden eine hohe Identifizierungsfähigkeit¹⁷. Die Untersuchung von Heilpflanzen auf der Grundlage von ITS2- und Chloroplasten-Genfragmenten hat die Fähigkeit zur Unterscheidung von Arten auf Artebene gezeigt, mit Anwendungen in den Bereichen Ressourcenschutz, Marktregulierung und internationaler Handel 17,18,19. Die Anwendung von DNA-Barcoding kann die Einschränkungen traditioneller Identifizierungsmethoden überwinden, was hilfreich ist, um die Qualität und Sicherheit von Heilpflanzen zu gewährleisten und Ressourcenmissbrauch und Verwirrung zu verhindern²⁰. Es hat sich als vorteilhaft für die Erforschung von Heilpflanzen erwiesen, unterstützt das Wachstum der Kräuterindustrie auf nachhaltige Weise und bietet eine Garantie, dass der Verbraucher die richtigen Medikamente einnimmt 21,22,23,24.

Das Papier skizziert Protokolle für die Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen am Beispiel von A. sinensis. Beim DNA-Barcoding werden ein oder mehrere standardisierte kurze genetische Marker in der DNA eines Organismus verwendet, um ihn als zu einer bestimmten Spezies gehörend zu erkennen. Die derzeitigen Methoden zur Identifizierung von Heilpflanzen haben gewisse Einschränkungen. Die traditionelle morphologische Identifizierung stützt sich stark auf die umfangreiche Erfahrung von Experten, die durch menschliche Faktoren beeinflusst werden kann, während die chemische Identifizierung anfällig für Probleme wie die Verfälschung von Schlüsselverbindungen ist. Im Gegensatz dazu bietet DNA-Barcoding ein genaueres Mittel zur Identifizierung von Spezies und bietet Vorteile wie Geschwindigkeit, hohe Reproduzierbarkeit und Stabilität. Darüber hinaus ermöglicht diese Technologie die zentrale Verwaltung und den Austausch vorhandener Artensequenzdaten über das Internet und Informationsplattformen, wodurch die Effizienz und Zuverlässigkeit der Artenbestimmung erheblich verbessert^{wird 11,12}. Aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie und ihrer ähnlichen medizinischen Bestandteile wird A. sinensis häufig mit anderen Arten verwechselt und häufig missbraucht oder absichtlich auf dem Markt substituiert²⁵. Yang et al. identifizierten A. anomala mithilfe von DNA-Barcoding, um es von falschen Medikamenten zu unterscheiden²⁶. Yuan et al. sammelten 23 Arten von Angelica und verwendeten DNA-Barcoding, um zwischen den verschiedenen Arten zu unterscheiden²⁷. Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren werden Benutzer in der Lage sein, pflanzliche medizinische Materialien von der Vorverarbeitung bis zum endgültigen Abgleich der Barcode-Sequenz mit der Barcode-Datenbank zu authentifizieren (Abbildung 1).

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

1. In der vorliegenden Studie wurde zweijähriges A. sinensis bei niedrigen Temperaturen und langer Sonneneinstrahlung in einer Höhe von 2800 m aus dem Kreis Min, Provinz Gansu, als Versuchsmaterial verwendet. Es wurden drei Pflanzen ausgewählt, von denen mehr als drei Wurzeln für die Experimente ausgewählt wurden. Spülen Sie die Wurzeln zuerst mit sterilisiertem Wasser ab und reinigen Sie sie dann mit einem Alkoholsprüher oder Alkoholtupfern, um Verunreinigungen zu vermeiden, die die Genauigkeit der Versuchsergebnisse beeinträchtigen könnten. Schneiden Sie die Wurzeln mit einem sterilisierten Skalpell in Stücke, die kleiner als 5 mm sind, und mischen Sie sie für die weitere Analyse. (Abbildung 2).
   HINWEIS: Alternativ können Sie die Wurzeln in flüssigen Stickstoff legen, um sie knusprig zu machen, damit sie leichter zu brechen sind. Je nach Form, Härte und anderen Eigenschaften der Heilpflanzen sollten Sie Instrumente verwenden, um mit ihnen umzugehen.
2. Bereiten Sie drei Röhrchen mit experimentellen Proben für parallele Experimente vor. Beschriften Sie jede Probe als AS-1, AS-2 und AS-3. Nehmen Sie etwa 100 mg frisches oder 20 mg trockenes Gewebe (luftgetrocknet) und geben Sie es in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
3. Legen Sie zwei 5 mm Edelstahlperlen in die 2 mL Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Röhrchen an eine Gewebeschleifmaschine mit hohem Durchsatz, die 60 s lang mit 60 Hz arbeitet.

2 DNA-Extraktion aus der Probe

HINWEIS: In dieser Studie wird ein pflanzengenomisches DNA-Extraktionskit verwendet, das auf der CTAB-Methode basiert. Die DNA-Extraktion wird gemäß der Bedienungsanleitung mit einigen Modifikationen durchgeführt, einschließlich der Hinzufügung eines einzigartigen nuklearen Isolationspuffers (NIB). Das Protokoll verbessert die DNA-Reinheit, indem es zunächst die Verunreinigungen vom Gewebe trennt und dann einen ersten Schritt zur Kernisolierung^{28, 29, 30} hinzufügt.

1. Geben Sie 800 μl vorgekühlte NIB hinzu und legen Sie die Probe unter 5-minütiger Vibration auf einen Vortex-Mischer.
2. In eine Zentrifuge geben und bei 13.780 x g 10 min verarbeiten. Entfernen Sie den Überstand.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2 für weitere 3 Runden.
   HINWEIS: NIB extrahiert DNA von höherer Qualität, und seine Zubereitung enthält einige gefährliche Chemikalien, die in einem Abzug gehandhabt werden müssen, was die Handhabung für Anfänger erschwert. Dieser Schritt ist jedoch nicht obligatorisch. Benutzer können sich dafür entscheiden, dieser Empfehlung zu folgen oder diese Schritte zu überspringen. Die detaillierte Formulierung ist in Tabelle 1 enthalten.
4. Fügen Sie 600 μl Puffer P1 und 5 μl RNase A (10 mg/ml) hinzu. Legen Sie die Probe auf einen Vortex-Mischer und den Wirbel zum Mischen. Inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad bei 65 °C für 1,5 h und drehen Sie die Röhrchen während der Inkubation 2x-3x um.
5. 200 μl Puffer P2 zugeben, gründlich mischen, 15 min auf Eis legen und dann 10 min bei 13.780 x g zentrifugieren.
6. Der Überstand wird vorsichtig auf eine Filtersäule AF abgesaugt, 2 min lang bei 13.780 x g zentrifugiert und das im Auffangröhrchen gesammelte untere Filtrat in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
7. Berechnen Sie das Volumen des Filtrats, fügen Sie das 1,5-fache des Volumens von P3 hinzu und schütteln Sie es sofort, um eine gemischte Lösung zu erhalten.
8. Geben Sie 650 μl der vorbereiteten Mischung in eine Adsorptionssäule Adsorptionssäule (AC) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang, dann zentrifugieren Sie sie bei 13.780 x g für 30-60 s.
9. Das in Schritt 2.8 erhaltene Filtrat wieder in die Klimaanlage geben, zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der restlichen gemischten Lösung aus Schritt 2.7.
10. 600 μl Spüllösung WB zugeben, bei 13.780 x g für 30 s zentrifugieren, die Abfalllösung verwerfen und den Vorgang 1x wiederholen.
11. Setzen Sie die AC-Säule wieder in das leere Auffangröhrchen ein, zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 13.780 x g und lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen, um Ethanolreste zu entfernen.
12. Nehmen Sie die Adsorptionssäule AC und legen Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 45 μl sterilisiertes deionisiertes Wasser (ddH₂O) in die Mitte der Adsorptionsmembran, die auf 65 °C erhitzt wurde. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen. Zentrifugieren bei 13.780 x g für 2 min.
13. Die resultierende Lösung wieder in die Säule geben und bei 13.780 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
14. Sammeln Sie die gefilterte Lösung. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA-Konzentration zu bestimmen. OD260 steht für die Absorption von Nukleinsäuren. Verwenden Sie die folgenden Kriterien für den DNA-Qualitätsbestimmungsstandard: OD260/OD280 = 1,80-2,00, der Normalbereich; OD260/OD280>2.00; es gibt eine große Menge an RNA-Kontamination; OD260/OD280<1,80, es gibt Proteine, Phenole und andere Verunreinigungen.

3 Amplifikation und Detektion von Zielfragmenten

HINWEIS: Wählen Sie geeignete Amplifikationsprimer basierend auf den vorgeschlagenen DNA-Barcoding-Regionen der Pflanze aus. Die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

1. Stellen Sie die Reaktionsbedingungen ein, die der Primer-Amplifikation entsprechen. Verwenden Sie 0,2 ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 9,5 μl ddH₂O, 12,5 μl 2x PCR-Mastermix und je 1 μl Forward-Primer, Reverse-Primer und Template-DNA gefüllt sind, um ein Gesamtvolumen von 25 μl zu erhalten. Bereiten Sie eine Negativkontrolle vor und ersetzen Sie das Template durch Wasser.
2. Fügen Sie 20 ml 1x Trisacetat-EDTA (TEA)-Puffer und 0,2 g Agarose zum Erhitzen hinzu und bereiten Sie ein 1%iges Agarosegel vor, fügen Sie dann 2 μl Nukleinsäure-Gelfärbung (10.000x) hinzu und mischen Sie gründlich. Gießen Sie die Mischung in eine Gelgießschale und lassen Sie sie sich verfestigen, um das Agarosegel zu erhalten. Geben Sie 3 μl des PCR-Produkts und 2 μl DNA-Marker 5000 bp in das Gel.
3. Stellen Sie die Spannung auf 120 V, den Strom auf 400 mA und die Elektrophorese auf 40 min ein. Verwenden Sie ein vielseitiges Gel-Bildanalysesystem, um Gele anzuzeigen und die Ergebnisse zu überprüfen.

4. Datenerhebung und -analyse

HINWEIS: Es gibt eine breite Palette von Software für die Sequenzzusammenstellung und -analyse. Zur Veranschaulichung verwenden wir den Codon-Code Aligner V11.0.1 und MEGA11 als Beispiele.

1. Verwenden Sie den Aligner, um die Sequenzierungsdatei zu öffnen, um das Peak-Map zu beobachten und die bidirektionalen Sequenzierungs-Peak-Map-Dateien zu spleißen.
   1. Wählen Sie Neues Projekt erstellen und klicken Sie auf OK , um zur Startseite der Software zu gelangen. Wählen Sie im Menü Datei die Option Samples hinzufügen , wählen Sie die zu verarbeitende Datei als Sequenz-Trace-Format aus und importieren Sie sie direkt in die Software als importierte Datei unter Unassembled Samples.
   2. Wählen Sie Contig aus, wählen Sie dann im Abschnitt Advanced Assembly (Erweiterte Baugruppe) und dann Assemble in Groups (In Gruppen einbauen) aus. Erstbenutzern, die nach der Auswahl von In Gruppen zusammenbauen ausgewählt haben, wird dieses Dialogfeld angezeigt: Wählen Sie Namen definieren. Ändern Sie die Teile für die Definition von Beispielnamen entsprechend dem Dateinamen und klicken Sie auf Assemble. Die ausgerichtete Sequenz wird angezeigt.
   3. Rufen Sie die vollständigen ITS2-Sequenzen gemäß der auf dem Hidden-Markov-Modell (HMM) basierenden Modellanalyse ab. Verwenden Sie die Sequenzen³¹ von 5,8 s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGT) und 28 (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC), um die ausgerichtete Sequenz von Anfang an zu durchsuchen und die Bereiche 5,8 und 28 s zu entfernen.
   4. Wählen Sie Los aus, wählen Sie dann im Abschnitt Suchsequenz aus , und klicken Sie auf OK , um die passende Sequenz abzurufen. Wählen Sie Contig aus, wählen Sie Delete in dem Abschnitt, um die 5,8s- und 28s-Regionen und die Sequenzen mit geringer Qualität zu entfernen, und dann gibt die Software die Spleißsequenzen zum Abgleichen aus.
2. Verwenden Sie die Spleißsequenzen, die aus den drei parallelen experimentellen Schritten zur Identifizierung erhalten wurden, wählen Sie die BLAST-Suche mit der Nukleotiddatenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) und wählen Sie das Species Identification Tool und den Specific Primer ITS2 aus, die in der GPGD-Datenbank (Global Pharmacopoeia Genome Database) entsprechen.
   HINWEIS: NCBI³² und GPGD³³ enthalten die Nukleotidsequenzen von Heilpflanzen und Tieren und sind als maßgebliche Datenbanken anerkannt. Ihre wichtigsten Methoden zur Identifizierung sind die Verfahren, die auf dem Sequenzvergleich³⁴ (BLAST) basieren. Die prozentuale Identität aus den Identitätsergebnissen wird verwendet, um zu bestimmen, ob die Art mit der größten Ähnlichkeit die Zielgattung ist.
3. Verwenden Sie MEGA11 für die Sequenzausrichtung, analysieren und vergleichen Sie intraspezifische und interspezifische Sequenzvariationen und erstellen Sie einen phylogenetischen Nachbar-Joining-Baum.
   1. Laden Sie die Sequenzen von drei Arten von Angelica und einer Art von Peucedanum praeruptorum als Outgroup vom NCBI herunter. Analysieren Sie diese Sequenzen zusammen mit der erhaltenen Ergebnissequenz.
   2. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie Datei/Sitzung öffnen , um die Datei zu importieren, und ein Dialogfeld wird angezeigt. Wählen Sie > DNA ausrichten und dann Ausrichten nach ClustalW für den Sequenzvergleich. Wählen Sie in Daten die Option Phylogenetische Analyse aus, und kehren Sie dann zur Startseite zurück. Klicken Sie auf Neighbor-Joining-Baum in PHYLOGENIE erstellen/testen. Die Software generiert einen phylogenetischen Baum.

Ergebnisse

DNA-Qualität der Probe

Der Bereich der OD260/OD280-Absorptionsverhältnisse lag zwischen 1,80 und 1,84. Die mit dem Spektralphotometer gemessene DNA-Menge für jede Probe betrug mehr als 100 ng/μl (Tabelle 3), was auf eine gute Qualität der DNA-Extraktion der Probe hinweist. Dies deutet darauf hin, dass die Proben während des Extraktionsprozesses nicht durch Proteine, RNA oder Reagenzien kontaminiert wurden und dass sie vo...

Diskussion

Die molekulare Identifikationstechnologie ist leichter zu erlernen und zu beherrschen als herkömmliche Identifizierungsmethoden. Sie überwindet die Grenzen der traditionellen Identifizierung von Heilkräutern, da sie nicht vom Wachstumsstadium der Pflanze beeinflusst wird und nicht auf subjektiver Beurteilung oder der Anhäufung von Fachkenntnissen beruht³⁵. Andere Arten werden aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie und ihrer medizinischen Bestandteile mit A....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.