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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'uso della tecnologia di codifica a barre del DNA per autenticare materiali medicinali di origine vegetale e la pianta medicinale Angelica sinensis (Oliv.) Diels è stato identificato come esempio.

Abstract

Le piante medicinali sono risorse preziose a livello globale e vengono utilizzate in tutto il mondo per mantenere la salute e curare le malattie; Tuttavia, la presenza di adulterazione ne ostacola lo sviluppo. Il DNA barcoding, una tecnica per l'identificazione delle specie da parte di regioni standard del DNA, facilita l'identificazione rapida e accurata delle piante medicinali tradizionali. Il processo di codifica a barre del DNA prevede sei passaggi fondamentali: 1) elaborazione delle piante medicinali, 2) estrazione di DNA totale di alta qualità dalle piante medicinali utilizzando il metodo della colonna centrifuga, 3) amplificazione dello spaziatore trascritto interno 2 della regione del DNA bersaglio (ITS2) con primer universali di piante ed esecuzione del sequenziamento Sanger, 4) sequenza di splicing e allineamento per ottenere la sequenza target, 5) corrispondenza della sequenza del codice a barre con la libreria di codici a barre per l'identificazione, 6) allineamento della sequenza, confronto della variazione intraspecifica e interspecifica, costruzione di un albero filogenetico di giunzione dei vicini. Come mostrato nei risultati, il primer universale può amplificare la regione target. Lo strumento di ricerca dell'allineamento locale di base (BLAST) dimostra che la percentuale identificata era del 100% e l'albero di giunzione adiacente dimostra che le sequenze di splicing erano raggruppate con il clade A. sinensis OR879715.1 e il valore di supporto del clade è 100. Questo protocollo fornisce un riferimento per l'applicazione della tecnologia del DNA barcoding come metodo efficace per identificare piante medicinali e adulteranti.

Introduzione

Le piante medicinali hanno una vasta gamma di effetti farmacologici e sono sostanze importanti per il trattamento e la prevenzione delle malattie. La domanda di mercato di piante medicinali in erboristeria e prodotti farmaceutici è enorme e ancora in crescita. Con l'aumento del mercato delle piante medicinali, il problema dell'adulterazione ha ostacolato lo sviluppo delle piante medicinali. Attualmente, l'adulterazione delle piante medicinali soffre di questi motivi: 1) la morfologia simile delle piante medicinali rende difficile identificarle e utilizzarle correttamente 1,2,3,4,5, 2) la crescente domanda di piante medicinali ha portato a un'offerta insufficiente sul mercato 6,7, 3) le piante medicinali sono costose e hanno prezzi fluttuanti, e l'uso di erbe economiche invece di materiali economicamente preziosi ha portato all'adulterazione e al profitto del mercato 8,9. Per risolvere i problemi della corretta identificazione e utilizzo delle piante medicinali, c'è bisogno di una tecnologia che consenta ai non specialisti di identificare la fonte10.

Ci sono limitazioni all'identificazione e all'uso corretto delle piante medicinali solo per l'aspetto e l'odore11. Per un'identificazione e un controllo di qualità più accurati, vengono impiegati metodi fisico-chimici12. La cromatografia su strato sottile (TLC), ad esempio, è un metodo rapido per identificare le erbe medicinali ed è inclusa nella Farmacopea cinese. Tuttavia, richiede norme di riferimento per identificare gli impianti13. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) può eseguire test sia qualitativi che quantitativi, il che la rende adatta per i test di qualità dei medicinali. Tuttavia, questo strumento è costoso e richiede conoscenze specialistiche per funzionare14,15. La tecnologia di codifica a barre del DNA è una tecnologia di identificazione delle specie rapida e accurata che identifica le specie utilizzando sequenze di DNA stabili per differenziare tra piante con morfologia simile. Hebert et al. hanno proposto la tecnologia di codifica a barre del DNA per identificare le specie, che utilizza una sequenza di DNA riconosciuta e relativamente breve all'interno del genoma16, Chen et al. hanno proposto ITS2 come sequenza universale per l'identificazione molecolare delle piante medicinali e hanno identificato più di 6600 piante e hanno trovato un'elevata capacità di identificazione17. Lo studio delle piante medicinali basato su ITS2 e frammenti genici di cloroplasti ha dimostrato la capacità di distinguere le specie a livello di specie, con applicazioni nei settori della protezione delle risorse, della regolamentazione del mercato e del commercio internazionale 17,18,19. L'applicazione del DNA barcoding può superare i limiti dei metodi di identificazione tradizionali, il che è utile per garantire la qualità e la sicurezza delle piante medicinali, prevenendo l'abuso di risorse e la confusione20. Si è dimostrato utile per lo studio delle piante medicinali, sostenendo la crescita dell'industria erboristica in modo sostenibile e fornendo la garanzia che il consumatore utilizzi il farmaco corretto 21,22,23,24.

Il documento delinea i protocolli su come applicare il codice a barre del DNA per identificare le piante medicinali utilizzando A. sinensis come esempio. Il DNA barcoding utilizza uno o più marcatori genetici corti standardizzati nel DNA di un organismo per riconoscerlo come appartenente a una particolare specie. I metodi attuali per identificare le piante medicinali hanno alcune limitazioni. L'identificazione morfologica tradizionale si basa in gran parte sulla vasta esperienza degli esperti, che può essere influenzata da fattori umani, mentre l'identificazione chimica è soggetta a problemi come l'adulterazione di composti chiave. Al contrario, il DNA barcoding fornisce un mezzo più accurato per l'identificazione delle specie, offrendo vantaggi come velocità, alta riproducibilità e stabilità. Inoltre, questa tecnologia consente la gestione centralizzata e la condivisione dei dati di sequenza delle specie esistenti attraverso Internet e piattaforme informative, migliorando significativamente l'efficienza e l'affidabilità dell'identificazione delle specie11,12. A causa della loro morfologia e delle parti medicinali simili, A. sinensis viene spesso confuso con altre specie ed è spesso utilizzato in modo improprio o intenzionalmente sostituito sul mercato25. Yang et al. hanno identificato A. anomala utilizzando il codice a barre del DNA per distinguerlo dai falsi farmaci26. Yuan et al. hanno raccolto 23 specie di Angelica e hanno utilizzato il DNA barcoding per distinguere tra le varie specie27. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli utenti saranno in grado di autenticare i materiali medicinali di origine vegetale dalla pre-elaborazione fino alla corrispondenza finale della sequenza di codici a barre con il database dei codici a barre (Figura 1).

Protocollo

1. Preparazione del campione

  1. Il presente studio ha utilizzato A. sinensis di due anni con bassa temperatura e lungo sole ad un'altitudine di 2800 m dalla contea di Min, nella provincia di Gansu, come materiali sperimentali. Sono state selezionate tre piante da cui sono state selezionate più di tre radici per la sperimentazione. Sciacquare prima le radici con acqua sterilizzata e poi pulirle con uno spruzzatore di alcol o tamponi imbevuti di alcol per evitare contaminazioni che potrebbero influire sull'accuratezza dei risultati sperimentali. Tagliare le radici in pezzi più piccoli di 5 mm utilizzando un bisturi sterilizzato e mescolare per ulteriori analisi. (Figura 2).
    NOTA: In alternativa, metti le radici nell'azoto liquido per renderle croccanti, rendendole più facili da rompere. A seconda della forma, della durezza e di altre caratteristiche delle piante medicinali, usa gli strumenti per affrontarle.
  2. Preparare tre provette di campioni sperimentali per esperimenti paralleli. Etichettare ogni campione come AS-1, AS-2 e AS-3. Prelevare circa 100 mg di fazzoletto fresco o 20 mg di fazzoletto secco (essiccato all'aria) e metterlo in una provetta da centrifuga da 2 ml.
  3. Inserire due perline di acciaio inossidabile da 5 mm nelle provette da centrifuga da 2 mL. Trasferire le provette in un trituratore di tessuti ad alta produttività funzionante a 60 Hz per 60 s.

2 Estrazione del DNA dal campione

NOTA: Questo studio utilizza un kit di estrazione del DNA genomico vegetale, basato sul metodo CTAB. L'estrazione del DNA viene eseguita seguendo il manuale di istruzioni con alcune modifiche, tra cui l'aggiunta di un esclusivo tampone di isolamento nucleare (NIB). Il protocollo migliora la purezza del DNA separando prima i contaminanti dal tessuto e poi aggiungendo una fase iniziale di isolamento dei nuclei 28,29,30.

  1. Aggiungere 800 μl di NIB pre-raffreddato e posizionare il campione su un miscelatore a vortice, facendo vibrare per 5 minuti.
  2. Mettere in una centrifuga e lavorare a 13.780 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante.
  3. Ripeti i passaggi 2.1-2.2 per altri 3 round.
    NOTA: Il NIB estrae DNA di qualità superiore e la sua preparazione contiene alcune sostanze chimiche pericolose che devono essere maneggiate in una cappa aspirante, rendendola più difficile da maneggiare per i principianti. Tuttavia, questo passaggio non è obbligatorio. Gli utenti possono scegliere di seguire questa raccomandazione o saltare questi passaggi. La sua formulazione dettagliata è nella Tabella 1.
  4. Aggiungere 600 μL di tampone P1 e 5 μL di RNasi A (10 mg/mL). Posizionare il campione su un miscelatore a vortice e mescolare a vortice. Incubare i campioni in un bagno d'acqua a 65 °C per 1,5 ore, capovolgendo le provette 2x-3x durante l'incubazione.
  5. Aggiungere 200 μl di tampone P2, mescolare accuratamente, mettere in ghiaccio per 15 minuti e centrifugare a 13.780 x g per 10 minuti.
  6. Aspirare con cautela il surnatante su una colonna filtrante AF, centrifugare a 13.780 x g per 2 minuti e trasferire il filtrato inferiore raccolto nella provetta di raccolta in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  7. Calcolare il volume del filtrato, aggiungere 1,5 volte il volume di P3 e agitare immediatamente per ottenere una soluzione miscelata.
  8. Aggiungere 650 μl della miscela preparata a una colonna adsorbente di adsorbimento (AC) e incubare per 5 minuti, quindi centrifugare a 13.780 x g per 30-60 s.
  9. Aggiungere nuovamente il filtrato ottenuto dal passaggio 2.8 all'AC, centrifugare ed eliminare il liquido di scarto. Ripetere la procedura con la restante soluzione miscelata del passaggio 2.7.
  10. Aggiungere 600 μl di soluzione di risciacquo WB, centrifugare a 13.780 x g per 30 s, scartare la soluzione di scarto e ripetere la procedura 1 volta.
  11. Riposizionare la colonna AC nella provetta di raccolta vuota, centrifugare a 13.780 x g per 2 minuti e lasciare a temperatura ambiente per rimuovere l'etanolo residuo.
  12. Prendere la colonna adsorbente AC e metterla in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mL. Aggiungere 45 μl di acqua deionizzata sterilizzata (ddH2O) al centro della membrana adsorbente, che è stata riscaldata a 65 °C. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 13.780 x g per 2 min.
  13. Aggiungere nuovamente la soluzione risultante alla colonna e centrifugare a 13.780 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
  14. Raccogli la soluzione filtrata. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione di DNA; OD260 rappresenta l'assorbanza degli acidi nucleici. Utilizzare i seguenti criteri per lo standard di determinazione della qualità del DNA: OD260/OD280=1,80-2,00, l'intervallo normale; OD260/OD280>2.00; c'è una grande quantità di contaminazione da RNA; OD260/OD280<1.80, ci sono proteine, fenoli e altri contaminanti.

3 Amplificazione e rilevamento di frammenti target

NOTA: Selezionare i primer di amplificazione appropriati in base alle regioni di codifica a barre del DNA proposte dalla pianta; le condizioni di reazione sono mostrate nella Tabella 2.

  1. Impostare le condizioni di reazione corrispondenti all'amplificazione del primer. Utilizzare provette da centrifuga da 0,2 mL riempite con 9,5 μL di ddH2O, 12,5 μL di 2x PCR Master Mix e 1 μL di primer diretto, primer inverso e DNA stampo per un volume totale di 25 μL. Preparare un controllo negativo, sostituendo il modello con acqua.
  2. Aggiungere 20 ml di tampone 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) e 0,2 g di agarosio per scaldare e preparare un gel di agarosio all'1%, quindi aggiungere 2 μl di colorante per gel di acido nucleico (10.000x) e mescolare accuratamente. Versare il composto in una vaschetta di colata di gel e lasciarlo solidificare per ottenere il gel di agarosio. Aggiungere al gel 3 μl del prodotto PCR e 2 μl di marcatore di DNA 5000 bp.
  3. Impostare la tensione a 120 V, la corrente a 400 mA e l'elettroforesi per 40 minuti. Utilizza un versatile sistema di analisi delle immagini su gel per visualizzare i gel e controllare i risultati.

4. Raccolta e analisi dei dati

NOTA: Esiste un'ampia gamma di software di assemblaggio e analisi delle sequenze; usiamo il codice Codone Aligner V11.0.1 e MEGA11 come esempi per l'illustrazione.

  1. Utilizzare l'allineatore per aprire il file di sequenziamento per osservare la mappa dei picchi e unire i file della mappa dei picchi di sequenziamento bidirezionale.
    1. Seleziona Crea un nuovo progetto e fai clic su OK per accedere alla home page del software. Selezionare Aggiungi campioni nel menu File, selezionare il file da elaborare come formato di traccia della sequenza e importarlo direttamente nel software come file importato in Campioni non assemblati.
    2. Selezionate Contig, quindi, nella sezione, selezionate Assemblaggio avanzato, quindi Assembla in gruppi (Assemble in Groups). I nuovi utenti, dopo aver selezionato Assembla in gruppi, vedranno questa finestra di dialogo: Scegliere Definisci nomi. Modificare le parti del nome del campione Define in base al nome del file e fare clic su Assembla. Verrà visualizzata la sequenza allineata.
    3. Recupera le sequenze ITS2 complete in base all'analisi del modello basato sul modello di Markov nascosto (HMM). Utilizzare le sequenze 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) e 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCCCACC)31 per cercare la sequenza allineata dall'inizio per rimuovere le regioni 5.8s e 28s.
    4. Seleziona Vai, quindi, nella sezione, seleziona Sequenza di ricerca e fai clic su OK per ottenere la sequenza corrispondente. Scegli Contig, scegli Elimina nella sezione per rimuovere le regioni 5.8s e 28s e le sequenze di bassa qualità, quindi il software emetterà le sequenze di giunzione per la corrispondenza.
  2. Utilizzare le sequenze di splicing ottenute dalle tre fasi sperimentali parallele per l'identificazione, selezionare la ricerca BLAST utilizzando il database nucleotidico presso il National Center for Biotechnology Information (NCBI) e selezionare lo strumento di identificazione delle specie e il primer specifico ITS2 corrispondenti nel database del database del genoma della farmacopea globale (GPGD).
    NOTA: NCBI32 e GPGD33 includono le sequenze nucleotidiche di piante medicinali e animali e sono riconosciuti come database autorevoli. I loro principali metodi di identificazione sono i metodi basati sul confronto di sequenze34 (BLAST). La percentuale di identità dei risultati dell'identità viene utilizzata per determinare se la specie con la maggiore somiglianza è il genere target.
  3. Utilizza MEGA11 per l'allineamento delle sequenze, analizza e confronta la variazione di sequenza intraspecifica e interspecifica e costruisci un albero filogenetico di unione dei vicini.
    1. Scarica le sequenze di tre specie di Angelica e una specie di Peucedanum praeruptorum come out-group da NCBI. Analizza queste sequenze insieme alla sequenza di risultati ottenuta.
    2. Fare clic su File, scegliere Apri un file/ sessione per importare il file e verrà visualizzata una finestra di dialogo. Scegliere Allinea > DNA e selezionare Allinea per clustalW per il confronto delle sequenze. Scegli Analisi filogenetica nei dati, quindi torna alla home page. Fare clic su Costruisci/Verifica albero di giunzione adiacente in FILOGENESI. Il software genera un albero filogenetico.

Risultati

Qualità del DNA del campione

L'intervallo dei rapporti di assorbanza OD260/OD280 era 1,80-1,84. La quantità di DNA misurata dallo spettrofotometro per ciascun campione era superiore a 100 ng/μL (Tabella 3), indicando una buona qualità dell'estrazione del DNA del campione. Ciò indica che i campioni non sono stati contaminati da proteine, RNA o reagenti durante il processo di estrazione e che erano di buona qualità e adatt...

Discussione

La tecnologia di identificazione molecolare è più facile da imparare e padroneggiare rispetto ai metodi di identificazione tradizionali. Supera i limiti dell'identificazione delle erbe medicinali tradizionali, in quanto non è influenzata dalla fase di crescita della pianta e non si basa sul giudizio soggettivo o sull'accumulo di competenze specialistiche35. Altre specie vengono confuse con A. sinensis a causa della sua morfologia simile e delle parti m...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che possano essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da introduce la persona di talento la ricerca scientifica start funds sovvenzionamento progetto di sovvenzione dell'Università di Chengdu di Medicina Tradizionale Cinese (030040015).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MSuitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acidBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BAdoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEQuantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidoneShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice MakerShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue HomogenizerBeyotime Biotechnology. F6623Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath KettleShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.

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