Applicazione del DNA Barcoding per identificare le piante medicinali

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'uso della tecnologia di codifica a barre del DNA per autenticare materiali medicinali di origine vegetale e la pianta medicinale Angelica sinensis (Oliv.) Diels è stato identificato come esempio.

Abstract

Le piante medicinali sono risorse preziose a livello globale e vengono utilizzate in tutto il mondo per mantenere la salute e curare le malattie; Tuttavia, la presenza di adulterazione ne ostacola lo sviluppo. Il DNA barcoding, una tecnica per l'identificazione delle specie da parte di regioni standard del DNA, facilita l'identificazione rapida e accurata delle piante medicinali tradizionali. Il processo di codifica a barre del DNA prevede sei passaggi fondamentali: 1) elaborazione delle piante medicinali, 2) estrazione di DNA totale di alta qualità dalle piante medicinali utilizzando il metodo della colonna centrifuga, 3) amplificazione dello spaziatore trascritto interno 2 della regione del DNA bersaglio (ITS2) con primer universali di piante ed esecuzione del sequenziamento Sanger, 4) sequenza di splicing e allineamento per ottenere la sequenza target, 5) corrispondenza della sequenza del codice a barre con la libreria di codici a barre per l'identificazione, 6) allineamento della sequenza, confronto della variazione intraspecifica e interspecifica, costruzione di un albero filogenetico di giunzione dei vicini. Come mostrato nei risultati, il primer universale può amplificare la regione target. Lo strumento di ricerca dell'allineamento locale di base (BLAST) dimostra che la percentuale identificata era del 100% e l'albero di giunzione adiacente dimostra che le sequenze di splicing erano raggruppate con il clade A. sinensis OR879715.1 e il valore di supporto del clade è 100. Questo protocollo fornisce un riferimento per l'applicazione della tecnologia del DNA barcoding come metodo efficace per identificare piante medicinali e adulteranti.

Introduzione

Le piante medicinali hanno una vasta gamma di effetti farmacologici e sono sostanze importanti per il trattamento e la prevenzione delle malattie. La domanda di mercato di piante medicinali in erboristeria e prodotti farmaceutici è enorme e ancora in crescita. Con l'aumento del mercato delle piante medicinali, il problema dell'adulterazione ha ostacolato lo sviluppo delle piante medicinali. Attualmente, l'adulterazione delle piante medicinali soffre di questi motivi: 1) la morfologia simile delle piante medicinali rende difficile identificarle e utilizzarle correttamente 1,2,3,4,5, 2) la crescente do....

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Il presente studio ha utilizzato A. sinensis di due anni con bassa temperatura e lungo sole ad un'altitudine di 2800 m dalla contea di Min, nella provincia di Gansu, come materiali sperimentali. Sono state selezionate tre piante da cui sono state selezionate più di tre radici per la sperimentazione. Sciacquare prima le radici con acqua sterilizzata e poi pulirle con uno spruzzatore di alcol o tamponi imbevuti di alcol per evitare contaminazioni che potrebbero influire sull'accuratezza dei risultati sperimentali. Tagliare le radici in pezzi più piccoli di 5 mm utilizzando....

Discussione

La tecnologia di identificazione molecolare è più facile da imparare e padroneggiare rispetto ai metodi di identificazione tradizionali. Supera i limiti dell'identificazione delle erbe medicinali tradizionali, in quanto non è influenzata dalla fase di crescita della pianta e non si basa sul giudizio soggettivo o sull'accumulo di competenze specialistiche³⁵. Altre specie vengono confuse con A. sinensis a causa della sua morfologia simile e delle parti m.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.