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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit l’utilisation de la technologie de codage à barres de l’ADN pour authentifier les matériaux médicinaux à base de plantes et la plante médicinale Angelica sinensis (Oliv.) Diels a été cité en exemple.

Résumé

Les plantes médicinales sont des ressources précieuses dans le monde entier et sont utilisées dans le monde entier pour maintenir la santé et traiter les maladies ; Cependant, la présence d’une falsification entrave leur développement. Le code-barres de l’ADN, une technique d’identification des espèces par des régions d’ADN standard, facilite l’identification rapide et précise des plantes médicinales traditionnelles. Le processus de codage à barres de l’ADN comporte six étapes de base : 1) le traitement des plantes médicinales, 2) l’extraction de l’ADN total de haute qualité des plantes médicinales à l’aide de la méthode de la colonne centrifuge, 3) l’amplification de l’espaceur 2 transcrit interne de la région de l’ADN cible (ITS2) avec des amorces universelles de plantes et la réalisation d’un séquençage de Sanger, 4) l’épissage et l’alignement de la séquence pour obtenir la séquence cible, 5) faire correspondre la séquence de code-barres avec la bibliothèque de codes-barres pour l’identification, 6) aligner la séquence, comparer les variations intraspécifiques et interspécifiques, construire un arbre phylogénétique de jonction de voisins. Comme le montrent les résultats, l’amorce universelle peut amplifier la région cible. L’outil de recherche d’alignement local de base (BLAST) démontre que le pourcentage identifié était de 100 %, et l’arbre de jonction de voisinage démontre que les séquences d’épissage ont été regroupées avec le clade A. sinensis OR879715.1 et que la valeur de support de clade est de 100. Ce protocole fournit une référence pour l’application de la technologie du codage à barres de l’ADN comme méthode efficace d’identification des plantes médicinales et des adultérants.

Introduction

Les plantes médicinales ont un large éventail d’effets pharmacologiques et sont des substances importantes pour le traitement et la prévention des maladies. La demande du marché pour les plantes médicinales dans les plantes médicinales et les produits pharmaceutiques est énorme et continue de croître. Avec l’augmentation du marché des plantes médicinales, le problème de la falsification a entravé le développement des plantes médicinales. Actuellement, l’adultération des plantes médicinales souffre des raisons suivantes : 1) la morphologie similaire des plantes médicinales rend difficile leur identification et leur utilisation correctes 1,2,3,4,5, 2) la demande croissante de plantes médicinales a entraîné une offre insuffisante sur le marché 6,7, 3) Les plantes médicinales sont chères et ont des prix fluctuants, et l’utilisation d’herbes bon marché au lieu de matériaux économiquement précieux a conduit à l’adultération et aux profits du marché 8,9. Pour résoudre les problèmes d’identification et d’utilisation correctes des plantes médicinales, il est nécessaire de disposer d’une technologie permettant aux non-spécialistes d’identifier la source10.

Il y a des limites à l’identification et à l’utilisation correctes des plantes médicinales uniquement par leur apparence et leur odeur11. Pour une identification plus précise et un contrôle de la qualité, des méthodes physico-chimiques sont utilisées12. La chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple, est une méthode rapide d’identification des plantes médicinales et est incluse dans la pharmacopée chinoise. Néanmoins, il faut des étalons de référence pour identifier les plantes13. La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) peut effectuer des tests qualitatifs et quantitatifs, ce qui la rend adaptée aux tests de qualité des médicaments. Cependant, cet instrument est coûteux et nécessite des connaissances spécialisées pour fonctionner14,15. La technologie de codage à barres de l’ADN est une technologie d’identification rapide et précise des espèces qui identifie les espèces en utilisant des séquences d’ADN stables pour différencier les plantes ayant une morphologie similaire. Hebert et al. ont proposé la technologie de codage à barres de l’ADN pour identifier les espèces, qui utilise une séquence d’ADN reconnue et relativement courte dans le génome16, Chen et al. ont proposé ITS2 comme séquence universelle pour l’identification moléculaire des plantes médicinales et ont identifié plus de 6600 plantes et ont trouvé une capacité d’identification élevée17. L’étude des plantes médicinales à partir d’ITS2 et de fragments de gènes de chloroplaste a démontré la capacité de distinguer les espèces au niveau de l’espèce, avec des applications dans les domaines de la protection des ressources, de la régulation des marchés et du commerce international 17,18,19. L’application du codage à barres de l’ADN peut surmonter les limites des méthodes d’identification traditionnelles, ce qui est utile pour garantir la qualité et la sécurité des plantes médicinales, prévenir l’abus des ressources et la confusion20. Il s’est avéré bénéfique pour l’étude des plantes médicinales, soutenant la croissance de l’industrie des plantes de manière durable et garantissant que le consommateur utilise le bon médicament 21,22,23,24.

L’article décrit des protocoles sur la façon d’appliquer le codage à barres de l’ADN pour identifier les plantes médicinales en utilisant A. sinensis comme exemple. Le codage à barres de l’ADN utilise un ou plusieurs marqueurs génétiques courts standardisés dans l’ADN d’un organisme pour le reconnaître comme appartenant à une espèce particulière. Les méthodes actuelles d’identification des plantes médicinales présentent certaines limites. L’identification morphologique traditionnelle repose en grande partie sur la vaste expérience des experts, qui peut être influencée par des facteurs humains, tandis que l’identification chimique est sujette à des problèmes tels que l’adultération de composés clés. En revanche, le codage à barres de l’ADN fournit un moyen plus précis d’identification des espèces, offrant des avantages tels que la vitesse, la reproductibilité élevée et la stabilité. De plus, cette technologie permet une gestion centralisée et le partage des données de séquence d’espèces existantes par le biais d’Internet et de plateformes d’information, ce qui améliore considérablement l’efficacité et la fiabilité de l’identification des espèces11,12. En raison de leur morphologie et de leurs parties médicinales similaires, A. sinensis est souvent confondu avec d’autres espèces et est fréquemment mal utilisé ou intentionnellement substitué sur le marché25. Yang et al. ont identifié A. anomala à l’aide d’un code-barres d’ADN pour le distinguer des faux médicaments26. Yuan et al. ont collecté 23 espèces d’Angelica et ont utilisé le codage à barres de l’ADN pour différencier les différentes espèces27. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les utilisateurs seront en mesure d’authentifier les matériaux médicinaux à base de plantes, du prétraitement à la correspondance finale de la séquence de code-barres avec la base de données de codes-barres (Figure 1).

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Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. La présente étude a utilisé A. sinensis , âgé de deux ans, avec une température basse et un long ensoleillement à une altitude de 2800 m du comté de Min, dans la province du Gansu, comme matériel expérimental. Trois plantes ont été sélectionnées parmi lesquelles plus de trois racines ont été sélectionnées pour l’expérimentation. Rincez d’abord les racines avec de l’eau stérilisée, puis nettoyez-les avec un pulvérisateur d’alcool ou des tampons imbibés d’alcool pour éviter toute contamination qui pourrait affecter la précision des résultats expérimentaux. Coupez les racines en morceaux de moins de 5 mm à l’aide d’un scalpel stérilisé et mélangez pour une analyse plus approfondie. (Figure 2).
    REMARQUE : Vous pouvez également placer les racines dans de l’azote liquide pour qu’elles soient croustillantes, ce qui les rend plus faciles à casser. En fonction de la forme, de la dureté et d’autres caractéristiques des plantes médicinales, utilisez des instruments pour les traiter.
  2. Préparez trois tubes d’échantillons expérimentaux pour des expériences parallèles. Étiquetez chaque échantillon comme AS-1, AS-2 et AS-3. Prenez environ 100 mg de tissu frais ou 20 mg de tissu sec (séché à l’air) et placez-le dans un tube à centrifuger de 2 ml.
  3. Placez deux billes en acier inoxydable de 5 mm dans les tubes à centrifuger de 2 ml. Transférez les tubes dans un broyeur de tissus à haut débit fonctionnant à 60 Hz pendant 60 s.

2 Extraction de l’ADN à partir d’un échantillon

REMARQUE : Cette étude utilise un kit d’extraction d’ADN génomique végétal, basé sur la méthode CTAB. L’extraction de l’ADN est effectuée conformément au manuel d’instructions avec quelques modifications, y compris l’ajout d’un tampon d’isolement nucléaire (NIB) unique. Le protocole améliore la pureté de l’ADN en séparant d’abord les contaminants du tissu, puis en ajoutant une étape initiale d’isolement des noyaux 28,29,30.

  1. Ajouter 800 μL de NIB pré-refroidi et placer l’échantillon sur un mélangeur vortex, en vibrant pendant 5 min.
  2. Placer dans une centrifugeuse et traiter à 13 780 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant.
  3. Répétez les étapes 2.1-2.2 pendant 3 tours supplémentaires.
    REMARQUE : NIB extrait de l’ADN de meilleure qualité et sa préparation contient des produits chimiques dangereux qui doivent être manipulés dans une hotte, ce qui le rend plus difficile à manipuler pour les novices. Cependant, cette étape n’est pas obligatoire. Les utilisateurs peuvent choisir de suivre cette recommandation ou d’ignorer ces étapes. Sa formulation détaillée se trouve dans le tableau 1.
  4. Ajouter 600 μL de tampon P1 et 5 μL de RNase A (10 mg/mL). Placez l’échantillon sur un mélangeur vortex et vortex à mélanger. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 65 °C pendant 1,5 h, en inversant les tubes 2x-3x pendant l’incubation.
  5. Ajouter 200 μL de tampon P2, bien mélanger, placer sur de la glace pendant 15 min, puis centrifuger à 13 780 x g pendant 10 min.
  6. Aspirez soigneusement le surnageant sur une colonne de filtre AF, centrifugez à 13 780 x g pendant 2 min et transférez le filtrat inférieur recueilli dans le tube de collecte dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL.
  7. Calculez le volume de filtrat, ajoutez 1,5 fois le volume de P3 et agitez immédiatement pour obtenir une solution mélangée.
  8. Ajouter 650 μL du mélange préparé dans une colonne d’adsorption et incuber pendant 5 min, puis centrifuger à 13 780 x g pendant 30 à 60 s.
  9. Ajouter à nouveau le filtrat obtenu à l’étape 2.8 dans le CA, centrifuger et jeter les déchets liquides. Répétez la procédure avec le reste de la solution mélangée de l’étape 2.7.
  10. Ajouter 600 μL de solution de rinçage WB, centrifuger à 13 780 x g pendant 30 s, jeter la solution de déchets et répéter la procédure 1 fois.
  11. Remettez la colonne AC dans le tube de collecte vide, centrifugez à 13 780 x g pendant 2 min et laissez à température ambiante pour éliminer l’éthanol résiduel.
  12. Prenez la colonne d’adsorbant AC et placez-la dans un tube à centrifuger propre de 1,5 ml. Ajoutez 45 μL d’eau désionisée stérilisée (ddH2O) au milieu de la membrane adsorbante, qui a été chauffée à 65 °C. Laisser à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 13 780 x g pendant 2 min.
  13. Ajouter la solution obtenue dans la colonne et centrifuger à 13 780 x g pendant 2 min à température ambiante.
  14. Récupérez la solution filtrée. Utiliser un spectrophotomètre pour déterminer la concentration d’ADN ; OD260 représente l’absorbance des acides nucléiques. Utilisez les critères suivants pour la norme de détermination de la qualité de l’ADN : OD260/OD280 = 1,80-2,00, la plage normale ; OD260/OD280>2.00 ; il y a une grande quantité de contamination par l’ARN ; OD260/OD280<1.80, il y a des protéines, des phénols et d’autres contaminants.

3 Amplification et détection de fragments cibles

REMARQUE : Choisir les amorces d’amplification appropriées en fonction des régions de codage à barres de l’ADN proposées par la plante ; Les conditions de réaction sont indiquées dans le tableau 2.

  1. Configurer les conditions de réaction correspondant à l’amplification de l’amorce. Utilisez des tubes à centrifuger de 0,2 ml remplis de 9,5 μL de ddH2O, 12,5 μL de 2x PCR Master Mix et 1 μL d’amorce directe, d’amorce inverse et d’ADN de matrice pour un volume total de 25 μL. Préparez un témoin négatif en remplaçant la matrice par de l’eau.
  2. Ajouter 20 ml de 1 tampon Tris Acétate-EDTA (TEA) et 0,2 g d’agarose à chauffer et préparer un gel d’agarose à 1 %, puis ajouter 2 μL de colorant de gel d’acide nucléique (10 000x) et bien mélanger. Versez le mélange dans un plateau de coulée de gel et laissez-le se solidifier pour obtenir le gel d’agarose. Ajouter 3 μL du produit PCR et 2 μL de marqueur ADN 5000 pb dans le gel.
  3. Réglez la tension à 120 V, le courant à 400 mA et l’électrophorèse pendant 40 min. Utilisez un système d’analyse d’images de gel polyvalent pour visualiser les gels et vérifier les résultats.

4. Collecte et analyse des données

REMARQUE : Il existe une large gamme de logiciels d’assemblage et d’analyse de séquences ; nous utilisons le code Codon Aligner V11.0.1 et MEGA11 comme exemples pour l’illustration.

  1. Utilisez l’aligneur pour ouvrir le fichier de séquençage afin d’observer la carte de pic et d’épisser les fichiers de carte de pic de séquençage bidirectionnels.
    1. Sélectionnez Créer un nouveau projet et cliquez sur OK pour accéder à la page d’accueil du logiciel. Sélectionnez Ajouter des échantillons dans le menu Fichier, sélectionnez le fichier à traiter au format de suivi de séquence et importez-le directement dans le logiciel en tant que fichier importé dans Échantillons non assemblés.
    2. Choisissez Contig, puis, dans la section, choisissez Assemblage avancé, puis choisissez Assembler en groupes. Les nouveaux utilisateurs, après avoir sélectionné Assembler en groupes, verront la boîte de dialogue suivante : Choisissez Définir les noms. Modifiez le nom de l’échantillon des pièces en fonction du nom du fichier et cliquez sur Assembler. La séquence alignée s’affiche.
    3. Récupérez les séquences ITS2 complètes selon l’analyse de modèle basée sur le modèle de Markov caché (HMM). Utilisez les séquences 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) et 28s (CGACCCCAGGTCAGGCAGGCGGGGGGCCACC)31 pour rechercher la séquence alignée depuis le début afin de supprimer les régions 5.8s et 28s.
    4. Sélectionnez OK, puis, dans la section, sélectionnez Séquence de recherche et cliquez sur OK pour obtenir la séquence correspondante. Choisissez Contig, choisissez Supprimer dans la section pour supprimer les régions 5.8s et 28s et les séquences de faible qualité, puis le logiciel affichera les séquences d’épissage pour la correspondance.
  2. Utilisez les séquences d’épissage obtenues à partir des trois étapes expérimentales parallèles pour l’identification, sélectionnez la recherche BLAST à l’aide de la base de données de nucléotides du National Center for Biotechnology Information (NCBI), puis sélectionnez l’outil d’identification des espèces et l’introduction spécifique ITS2 correspondant dans la base de données GPGD (Global Pharmacopoeia Genome Database).
    REMARQUE : NCBI32 et GPGD33 incluent les séquences nucléotidiques des plantes et des animaux médicinaux et sont reconnues comme des bases de données faisant autorité. Leurs principales méthodes d’identification sont les méthodes basées sur la comparaison de séquences34 (BLAST). Le pourcentage d’identité à partir des résultats de l’identité est utilisé pour déterminer si l’espèce présentant la plus grande similitude est le genre cible.
  3. Utilisez MEGA11 pour l’alignement des séquences, analysez et comparez les variations de séquences intraspécifiques et interspécifiques, et construisez un arbre phylogénétique de jonction de voisins.
    1. Téléchargez les séquences de trois espèces d’Angelica et d’une espèce de Peucedanum praeruptorum en tant qu’exogroupe du NCBI. Analysez ces séquences avec la séquence de résultat obtenue.
    2. Cliquez sur Fichier, choisissez Ouvrir un fichier/une session pour importer le fichier, et une boîte de dialogue apparaîtra. Choisissez Aligner > ADN, puis sélectionnez Aligner par ClustalW pour la comparaison de séquences. Choisissez Analyse phylogénétique dans les données, puis revenez à la page d’accueil. Cliquez sur Construire/Tester l’arbre de jonction de voisins dans PHYLOGÉNIE. Le logiciel génère un arbre phylogénétique.

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Résultats

Qualité de l’ADN de l’échantillon

La plage des rapports d’absorbance OD260/OD280 était de 1,80 à 1,84. La quantité d’ADN mesurée par spectrophotomètre pour chaque échantillon était supérieure à 100 ng/μL (tableau 3), ce qui indique une bonne qualité d’extraction de l’ADN de l’échantillon. Cela indique que les échantillons n’ont pas été contaminés par des protéines, de l’ARN ou des réactifs...

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Discussion

La technologie d’identification moléculaire est plus facile à apprendre et à maîtriser que les méthodes d’identification traditionnelles. Il surmonte les limites de l’identification traditionnelle des plantes médicinales, car il n’est pas affecté par le stade de croissance de la plante et ne repose pas sur un jugement subjectif ou l’accumulation d’une expertise spécialisée35. D’autres espèces sont confondues avec A. sinensis en rai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la personne talentueuse recherche scientifique commencer fonds projet de subvention de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (030040015).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MSuitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acidBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BAdoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEQuantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidoneShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice MakerShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue HomogenizerBeyotime Biotechnology. F6623Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath KettleShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.

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