약용 식물을 식별하기 위한 DNA 바코드 적용

요약

본 프로토콜은 식물 기반 의약 물질을 인증하기 위해 DNA 바코드 기술을 사용하는 것을 설명하고 있으며, 약용 식물 Angelica sinensis (Oliv.) Diels가 그 예로 확인되었습니다.

초록

약용 식물은 전 세계적으로 귀중한 자원이며 건강을 유지하고 질병을 치료하는 데 전 세계적으로 사용됩니다. 그러나 불순물의 존재는 그들의 발달을 방해합니다. 표준 DNA 영역으로 종을 식별하는 기술인 DNA 바코드는 전통적인 약용 식물의 신속하고 정확한 식별을 용이하게 합니다. DNA 바코드 작성 과정은 1) 약용 식물 가공, 2) 원심 컬럼 방법을 사용하여 약용 식물에서 고품질 총 DNA 추출, 3) 식물의 범용 프라이머로 표적 DNA 영역 내부 전사 스페이서 2(ITS2)를 증폭하고 Sanger 염기서열 분석 수행, 4) 표적 염기서열을 얻기 위해 염기서열을 접합 및 정렬하는 6가지 기본 단계를 수반합니다. 5) 식별을 위해 바코드 라이브러리와 바코드 시퀀스를 일치시키고, 6) 시퀀스를 정렬하고, 종내 및 종간 변이를 비교하고, 계통발생 이웃 조인 트리를 구성합니다. 결과에서 볼 수 있듯이 범용 프라이머는 타겟 영역을 증폭할 수 있습니다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 식별된 백분율이 100%임을 보여주고, 인접 결합 트리는 접합 시퀀스가 A. sinensis OR879715.1 clade로 클러스터링되었으며 clade 지지 값이 100임을 보여줍니다. 이 프로토콜은 약용 식물 및 불순물을 식별하는 효과적인 방법으로 DNA 바코드 기술을 적용하기 위한 참조를 제공합니다.

서문

약용 식물은 광범위한 약리 효과를 가지고 있으며 질병의 치료 및 예방에 중요한 물질입니다. 생약 및 의약품의 약용 식물에 대한 시장 수요는 거대하며 여전히 증가하고 있습니다. 약용 식물의 시장이 증가함에 따라 불순물 문제는 약용 식물의 개발을 방해했습니다. 현재 약용식물의 불순물은 다음과 같은 이유로 어려움을 겪고 있다: 1) 약용식물의 유사한 형태는 약용식물을 올바르게 식별하고 사용하기 어렵게 만든다 1,2,3,4,5 2) 약용식물에 대한 수요 증가로 인해 시장에서의 공급이 부족 하다 ^6,7, 3) 약용 식물은 비싸고 가격 변동이 심하며, 경제적으로 가치 있는 재료 대신 값싼 허브를 사용함으로써 불순물과 시장 폭리를 초래하고 있다 ^8,9. 약용 식물의 적절한 식별 및 사용 문제를 해결하기 위해서는 비전문가가 출처를 식별할 수 있는 기술이 필요하다(¹⁰).

외관과 냄새만으로 약용식물을 제대로 식별하고 사용하는 것은 한계가 있다¹¹. 보다 정확한 식별 및 품질 관리를 위해 물리화학적 방법을 사용합니다¹². 예를 들어, 박층 크로마토그래피(TLC)는 약초를 빠르게 식별할 수 있는 방법이며 중국 약전에 포함되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 식물을 식별하기 위한 참조 표준이 필요하다¹³. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 정성적 및 정량적 테스트를 모두 수행할 수 있으므로 의약품 품질 테스트에 적합합니다. 그러나 이 기기는 비싸고^14,15를 작동하려면 전문 지식이 필요합니다. DNA 바코드 기술은 안정적인 DNA 염기서열을 사용하여 유사한 형태를 가진 식물을 구별하여 종을 식별하는 빠르고 정확한 종 식별 기술입니다. Hebert et al.은 게놈 내에서 인식되고 상대적으로 짧은 DNA 서열을 사용하는 종을 식별하기 위한 DNA 바코드 기술을 제안했으며(¹⁶), Chen et al.은 약용 식물의 분자 식별을 위한 보편적인 서열로 ITS2를 제안하고 6600개 이상의 식물을 식별했으며 높은 식별 능력을 발견했습니다¹⁷. ITS2 및 엽록체 유전자 단편을 기반으로 한 약용 식물에 대한 연구는 자원 보호, 시장 규제 및 국제 무역 분야의 응용을 통해 종 수준에서 종을 구별할 수 있는 능력을 입증했습니다 17,18,19. DNA 바코드의 적용은 기존 식별 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 이는 약용 식물의 품질과 안전성을 보장하고 자원 남용 및 혼란을 방지하는 데 도움이 됩니다²⁰. 약용 식물을 연구하고, 지속 가능한 방식으로 허브 산업의 성장을 지원하며, 소비자가 올바른 약물을 사용한다는 보장을 제공하는 데 유익한 것으로 입증되었습니다 21,22,23,24.

이 논문에서는 A. sinensis를 예로 들어 약용 식물을 식별하기 위해 DNA 바코드를 적용하는 방법에 대한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. DNA 바코드는 유기체의 DNA에서 하나 이상의 표준화된 짧은 유전자 마커를 사용하여 특정 종에 속하는 것으로 인식합니다. 현재의 약용 식물을 식별하는 방법에는 특정 한계가 있습니다. 전통적인 형태학적 식별은 인적 요인의 영향을 받을 수 있는 전문가의 광범위한 경험에 크게 의존하는 반면, 화학적 식별은 주요 화합물의 불순물과 같은 문제가 발생하기 쉽습니다. 대조적으로, DNA 바코드는 보다 정확한 종 식별 수단을 제공하여 속도, 높은 재현성 및 안정성과 같은 이점을 제공합니다. 또한, 이 기술은 인터넷 및 정보 플랫폼을 통해 기존 종 서열 데이터를 중앙 집중식으로 관리하고 공유할 수 있도록 하여 종 식별의 효율성과 신뢰성을 크게 향상시킵니다^11,12. 유사한 형태와 의약 부분으로 인해 A. sinensis는 종종 다른 종과 혼동되며 시장에서 자주 오용되거나 의도적으로 대체됩니다²⁵. Yang et al.은 A. anomala를 가짜 약물과 구별하기 위해 DNA 바코드를 사용하여 식별했습니다²⁶. Yuan et al.은 23 종의 안젤리카를 수집하고 DNA 바코드를 사용하여^{다양한 종 27}을 구별했습니다. 이 프로토콜에 설명된 절차를 따르면 사용자는 전처리부터 최종적으로 바코드 시퀀스를 바코드 데이터베이스와 일치시킬 때까지 식물 기반 의약 물질을 인증할 수 있습니다(그림 1).

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 이번 연구는 간쑤(甘肅)성 민현(新縣)에서 해발 2800m의 낮은 기온과 긴 일조량을 가진 2년생 A. sinensis를 실험 재료로 활용했다. 실험을 위해 3 개 이상의 뿌리를 선택한 3 개의 식물을 선택했습니다. 먼저 멸균수로 뿌리를 헹구고 알코올 분무기나 알코올 면봉으로 세척하여 실험 결과의 정확도에 영향을 줄 수 있는 오염을 방지합니다. 멸균된 메스를 사용하여 뿌리를 5mm보다 작은 조각으로 자르고 추가 분석을 위해 혼합합니다. (그림 2).
   알림: 또는 뿌리를 액체 질소에 넣어 바삭하게 만들어 쉽게 부러뜨릴 수 있습니다. 약용 식물의 모양, 경도 및 기타 특성에 따라 도구를 사용하여 처리하십시오.
2. 병렬 실험을 위해 3개의 실험 샘플 튜브를 준비합니다. 각 샘플에 AS-1, AS-2 및 AS-3으로 레이블을 지정합니다. 약 100mg의 신선 또는 20mg의 건조 중량 조직(자연 건조)을 2mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
3. 2개의 5mm 스테인리스강 비드를 2mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브를 60Hz 동안 60Hz에서 작동하는 고처리량 조직 분쇄기로 옮깁니다.

2 샘플에서 DNA 추출

참고: 이 연구는 CTAB 방법을 기반으로 하는 식물 게놈 DNA 추출 키트를 사용합니다. DNA 추출은 고유한 핵 격리 완충액(NIB)의 추가를 포함하여 몇 가지 수정 사항을 포함하여 사용 설명서에 따라 수행됩니다. 이 프로토콜은 먼저 조직에서 오염 물질을 분리한 다음 초기 핵 분리 단계 28,29,30을 추가하여 DNA 순도를 향상시킵니다.

1. 800μL의 사전 냉각된 NIB를 추가하고 샘플을 와류 믹서에 놓고 5분 동안 진동합니다.
2. 원심분리기에 넣고 13,780 x g 에서 10분 동안 처리합니다. 상층액을 제거합니다.
3. 2.1-2.2단계를 추가로 3회 반복합니다.
   참고: NIB는 더 높은 품질의 DNA를 추출하며, 그 제제에는 흄 후드에서 처리해야 하는 일부 유해 화학 물질이 포함되어 있어 초보자가 다루기가 더 어렵습니다. 그러나 이 단계는 필수는 아닙니다. 사용자는 이 권장 사항을 따르거나 이 단계를 건너뛸 수 있습니다. 그것의 상세한 정립은 표 1에 나타내어져 있다.
4. 600 μL의 완충액 P1과 5 μL의 RNase A(10 mg/mL)를 추가합니다. 샘플을 와류 믹서에 놓고 와류하여 혼합합니다. 65°C의 수조에서 1.5시간 동안 샘플을 배양하고 배양하는 동안 튜브를 2x-3x 뒤집습니다.
5. 완충액 P2 200μL를 넣고 잘 섞은 다음 얼음 위에 15분 동안 두른 다음 13,780 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
6. 상층액을 필터 컬럼 AF에 조심스럽게 흡입하고 13,780 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 수집 튜브에 수집된 하부 여과액을 새 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
7. 여과액의 부피를 계산하고 P3 부피의 1.5배를 추가한 다음 즉시 흔들어 혼합 용액을 얻습니다.
8. 준비된 혼합물 650μL를 흡착 컬럼 흡착 컬럼(AC)에 넣고 5분 동안 배양한 다음 13,780 x g 에서 30-60초 동안 원심분리합니다.
9. 2.8단계에서 얻은 여과액을 다시 AC에 넣고 원심분리한 후 폐액을 버립니다. 2.7단계의 나머지 혼합 용액으로 절차를 반복합니다.
10. 600 μL의 헹굼 용액 WB를 넣고 13,780 x g 에서 30 초 동안 원심 분리 한 다음 폐기물 용액을 버리고 절차를 1x 반복합니다.
11. 컬럼 AC를 빈 수집 튜브에 다시 넣고 13,780 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 실온에서 그대로 두어 잔류 에탄올을 제거합니다.
12. 흡착제 컬럼 AC를 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 65°C로 가열된 흡착막 중앙에 45μL의 멸균 탈이온수(ddH₂O)를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 13,780 x g 에서 2분 동안 원심분리기
13. 생성된 용액을 컬럼에 다시 추가하고 실온에서 2분 동안 13,780 x g 으로 원심분리합니다.
14. 필터링된 용액을 수집합니다. DNA 농도를 결정하기 위해 분광 광도계를 사용하십시오. OD260은 핵산의 흡광도를 나타냅니다. DNA 품질 측정 표준을 위해 다음 기준을 사용하십시오 : OD260 / OD280 = 1.80-2.00, 정상 범위; OD260 / OD280 > 2.00; 많은 양의 RNA 오염이 있습니다. OD260/OD280<1.80, 단백질, 페놀 및 기타 오염 물질이 있습니다.

3 Target fragment 증폭 및 검출

참고: 식물의 제안된 DNA 바코드 영역을 기반으로 적절한 증폭 프라이머를 선택하십시오. 반응 조건은 표 2에 나타내었다.

1. 프라이머 증폭에 해당하는 반응 조건을 설정합니다. 9.5 μL의 ddH₂O, 12.5 μL의 2x PCR Master Mix, 1 μL의 forward primer, reverse primer 및 template DNA를 각각 1 μL로 채워 총 부피 25 μL의 0.2 mL 원심분리기 튜브를 사용합니다. 템플릿을 물로 교체하여 음성 대조군을 준비합니다.
2. 1x Tris Acetate-EDTA(TEA) 완충액 20mL와 아가로스 0.2g을 넣어 가열하고 1% 아가로스 겔을 제조한 다음 핵산 겔 염색 2μL(10,000×)를 넣고 잘 섞는다. 혼합물을 겔 주조 트레이에 붓고 응고시켜 아가로스 겔을 얻도록 합니다. PCR 산물 3μL와 DNA 마커 5000bp 2μL를 겔에 첨가합니다.
3. 전압을 120V, 전류를 400mA, 전기영동을 40분 동안 설정합니다. 다용도 겔 이미지 분석 시스템을 사용하여 겔을 보고 결과를 확인할 수 있습니다.

4. 데이터 수집 및 분석

참고: 다양한 시퀀스 조립 및 분석 소프트웨어가 있습니다. 설명을 위해 Codon 코드 Aligner V11.0.1 및 MEGA11을 사용합니다.

1. 얼라이너를 사용하여 염기서열분석 파일을 열어 피크 맵을 관찰하고 양방향 염기서열분석 피크 맵 파일을 접합합니다.
   1. Create a New Project(새 프로젝트 만들기)를 선택하고 OK(확인)를 클릭하여 소프트웨어 홈페이지로 이동합니다. File(파일) 메뉴에서 Add Samples(샘플 추가)를 선택하고, 시퀀스 추적 형식으로 처리할 파일을 선택한 다음, Unassembled Samples에서 가져온 파일로 소프트웨어에 직접 가져옵니다.
   2. [Contig]를 선택한 다음, 섹션에서 [Advanced Assembly]를 선택한 다음 [Assemble in Groups]를 선택합니다. 처음 사용하는 사용자는 Assemble in Groups를 선택한 후 다음 대화 상자를 볼 수 있습니다. 이름 정의를 선택합니다. 파일 이름에 따라 Define sample name parts를 수정하고 Assemble을 클릭합니다. 정렬된 순서가 표시됩니다.
   3. HMM(Hidden Markov Model) 기반 모델 분석에 따라 전체 ITS2 시퀀스를 검색합니다. 5.8s(CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) 및 28s(CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC) 시퀀스³¹ 을 사용하여 정렬된 시퀀스를 처음부터 검색하여 5.8s 및 28s 영역을 제거합니다.
   4. Go(이동)를 선택한 다음, 섹션에서 Search Sequence(검색 순서)를 선택하고 OK(확인)를 클릭하여 일치하는 시퀀스를 가져옵니다. Contig를 선택하고 섹션에서 Delete를 선택하여 5.8s 및 28s 영역과 저품질 시퀀스를 제거한 다음 소프트웨어가 일치를 위해 스플라이싱 시퀀스를 출력합니다.
2. 식별을 위해 3개의 병렬 실험 단계에서 얻은 스플라이싱 서열을 사용하고, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 뉴클레오티드 데이터베이스를 사용하여 BLAST 검색을 선택하고, GPGD(Global Pharmacopoeia Genome Database) 데이터베이스에서 해당 종 식별 도구 및 특정 Primer ITS2 를 선택합니다.
   참고: NCBI³² 및 GPGD³³ 에는 약용 식물 및 동물의 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있으며 권위 있는 데이터베이스로 인정됩니다. 이들의 주요 식별 방법은 서열 비교³⁴ (BLAST)에 기초한 방법이다. 식별 결과의 백분율 동일성은 가장 큰 유사성을 가진 종이 대상 속인지 여부를 결정하는 데 사용됩니다.
3. 염기서열 정렬을 위해 MEGA11을 사용하고, 종내 및 종간 염기서열 변동을 분석 및 비교하고, 계통발생 이웃 조인 트리를 구성합니다.
   1. NCBI에서 3종의 Angelica와 1종의 Peucedanum praeruptorum의 염기서열을 out-group으로 다운로드합니다. 얻어진 결과 시퀀스와 함께 이러한 시퀀스를 분석합니다.
   2. File(파일)을 클릭하고 Open a File/Session(파일/세션 열기)을 선택하여 파일을 가져오면 대화 상자가 나타납니다. Align > DNA(DNA 정렬)를 선택하고 염기서열 비교를 위해 Align by ClustalW를 선택합니다. 데이터에서 계통발생 분석(Phylogenetic analysis)을 선택한 다음 홈 페이지로 돌아갑니다. PHYLOGENY에서 Construct/Test Neighbor-Joining Tree를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 계통 발생 트리를 생성합니다.

결과

시료 DNA 품질

OD260/OD280 흡광도 비율의 범위는 1.80-1.84였습니다. 각 샘플에 대해 분광광도계로 측정한 DNA 양은 100ng/μL 이상이었으며(표 3) 이는 샘플 DNA 추출의 품질이 우수함을 나타냅니다. 이는 샘플이 추출 과정에서 단백질, RNA 또는 시약에 의해 오염되지 않았으며 품질이 양호하고 다운스트림 PCR 증폭에 적합함을 나타냅니?...

토론

분자 식별 기술은 기존 식별 방법보다 배우고 숙달하기가 더 쉽습니다. 이는 식물의 성장 단계에 영향을 받지 않고 주관적인 판단이나 전문 지식의 축적에 의존하지 않기 때문에 전통적인 약초 식별의 한계를 극복한다³⁵. 다른 종은 유사한 형태와 의약 부분으로 인해 A. sinensis 와 혼동되지만 DNA 바코드를 사용하면 확실히 식별 할 수 있습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.