약용 식물을 식별하기 위한 DNA 바코드 적용

요약

본 프로토콜은 식물 기반 의약 물질을 인증하기 위해 DNA 바코드 기술을 사용하는 것을 설명하고 있으며, 약용 식물 Angelica sinensis (Oliv.) Diels가 그 예로 확인되었습니다.

초록

약용 식물은 전 세계적으로 귀중한 자원이며 건강을 유지하고 질병을 치료하는 데 전 세계적으로 사용됩니다. 그러나 불순물의 존재는 그들의 발달을 방해합니다. 표준 DNA 영역으로 종을 식별하는 기술인 DNA 바코드는 전통적인 약용 식물의 신속하고 정확한 식별을 용이하게 합니다. DNA 바코드 작성 과정은 1) 약용 식물 가공, 2) 원심 컬럼 방법을 사용하여 약용 식물에서 고품질 총 DNA 추출, 3) 식물의 범용 프라이머로 표적 DNA 영역 내부 전사 스페이서 2(ITS2)를 증폭하고 Sanger 염기서열 분석 수행, 4) 표적 염기서열을 얻기 위해 염기서열을 접합 및 정렬하는 6가지 기본 단계를 수반합니다. 5) 식별을 위해 바코드 라이브러리와 바코드 시퀀스를 일치시키고, 6) 시퀀스를 정렬하고, 종내 및 종간 변이를 비교하고, 계통발생 이웃 조인 트리를 구성합니다. 결과에서 볼 수 있듯이 범용 프라이머는 타겟 영역을 증폭할 수 있습니다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 식별된 백분율이 100%임을 보여주고, 인접 결합 트리는 접합 시퀀스가 A. sinensis OR879715.1 clade로 클러스터링되었으며 clade 지지 값이 100임을 보여줍니다. 이 프로토콜은 약용 식물 및 불순물을 식별하는 효과적인 방법으로 DNA 바코드 기술을 적용하기 위한 참조를 제공합니다.

서문

약용 식물은 광범위한 약리 효과를 가지고 있으며 질병의 치료 및 예방에 중요한 물질입니다. 생약 및 의약품의 약용 식물에 대한 시장 수요는 거대하며 여전히 증가하고 있습니다. 약용 식물의 시장이 증가함에 따라 불순물 문제는 약용 식물의 개발을 방해했습니다. 현재 약용식물의 불순물은 다음과 같은 이유로 어려움을 겪고 있다: 1) 약용식물의 유사한 형태는 약용식물을 올바르게 식별하고 사용하기 어렵게 만든다 1,2,3,4,5 2) 약용식물에 대한 수요 증가로 인해 시장에서의 공급이 부족 하다 ^6,7, 3) 약용 식물은 비싸고 가격 변동이 심하며, 경제적으로 가치 있는 재료 대신 값싼 허브를 사용함으로써 불순물과 시장 폭리를 초래하고 있다 ^8,9

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 이번 연구는 간쑤(甘肅)성 민현(新縣)에서 해발 2800m의 낮은 기온과 긴 일조량을 가진 2년생 A. sinensis를 실험 재료로 활용했다. 실험을 위해 3 개 이상의 뿌리를 선택한 3 개의 식물을 선택했습니다. 먼저 멸균수로 뿌리를 헹구고 알코올 분무기나 알코올 면봉으로 세척하여 실험 결과의 정확도에 영향을 줄 수 있는 오염을 방지합니다. 멸균된 메스를 사용하여 뿌리를 5mm보다 작은 조각으로 자르고 추가 분석을 위해 혼합합니다. (그림 2).
   알림: 또는 뿌리를 액체 질소에 넣어 바삭하게 만들어 쉽게 부러뜨릴 수 있습니다. 약용 식물의 모양, 경도 및 기타 특성에 따라 도구를 사용하여 처리하십시오.
2. 병렬 실험을 위해 3개의 실험 샘플 튜브를 준비합니다. 각 샘플에 AS-1, AS-2 및 AS-3으로 레이블을 지정합니다. 약 100mg의 신선 또는 20mg의 건조 중량 조직(자연 건조)을 2mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
3. 2개의 5mm 스테인리스강 비드를 2mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브를 60Hz 동안 60Hz에서 작동하는 고처리량 조직 분쇄기....

결과

시료 DNA 품질

OD260/OD280 흡광도 비율의 범위는 1.80-1.84였습니다. 각 샘플에 대해 분광광도계로 측정한 DNA 양은 100ng/μL 이상이었으며(표 3) 이는 샘플 DNA 추출의 품질이 우수함을 나타냅니다. 이는 샘플이 추출 과정에서 단백질, RNA 또는 시약에 의해 오염되지 않았으며 품질이 양호하고 다운스트림 PCR 증폭에 적합함을 나타냅니?.......

토론

분자 식별 기술은 기존 식별 방법보다 배우고 숙달하기가 더 쉽습니다. 이는 식물의 성장 단계에 영향을 받지 않고 주관적인 판단이나 전문 지식의 축적에 의존하지 않기 때문에 전통적인 약초 식별의 한계를 극복한다³⁵. 다른 종은 유사한 형태와 의약 부분으로 인해 A. sinensis 와 혼동되지만 DNA 바코드를 사용하면 확실히 식별 할 수 있습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.