薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

要約

本プロトコルでは、DNAバーコーディング技術を使用して植物由来の薬用材料を認証し、薬用植物 Angelica sinensis (Oliv.)ディールズは例として挙げられました。

要約

薬用植物は世界的に貴重な資源であり、健康を維持し、病気を治療するために世界中で使用されています。しかし、不純物の存在はそれらの発達を妨げます。DNAバーコーディングは、標準的なDNA領域による種同定技術であり、従来の薬用植物の迅速かつ正確な同定を容易にします。DNAバーコーディングのプロセスは、6つの基本的なステップを伴います:1)薬用植物の処理、2)遠心カラム法を使用して薬用植物から高品質の総DNAを抽出する、3)植物のユニバーサルプライマーで標的DNA領域内部転写スペーサー2(ITS2)を増幅し、サンガーシーケンシングを実行する、4)スプライシングとアラインメントシーケンスを使用してターゲット配列を取得し、 5)バーコード配列をバーコードライブラリと照合して識別し、6)配列を整列させ、種内および種間変異を比較し、系統発生的な隣接結合ツリーを構築します。結果に示されているように、ユニバーサルプライマーは標的領域を増幅することができます。Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) は、特定されたパーセンテージが 100% であることを示し、隣接結合ツリーは、スプライシング シーケンスが A. sinensis OR879715.1 クレードでクラスター化され、クレード支持値が 100 であることを示しています。このプロトコルは、薬用植物や不純物を同定する効果的な方法としてDNAバーコーディング技術を適用するための参考資料を提供します。

概要

薬用植物は幅広い薬理作用を持ち、病気の治療や予防に重要な物質です。漢方薬や医薬品の薬用植物に対する市場の需要は膨大で、現在も成長しています。薬用植物の市場が拡大するにつれて、偽和の問題は薬用植物の開発を妨げてきました。現在、薬用植物の偽和物はこれらの理由に苦しんでいます:1)薬用植物の類似した形態は、それらを正しく識別して使用することを困難にします1,2,3,4,5、2)薬用植物の需要の増加により、市場での供給が不十分になっています^6,7、3)薬用植物は高価で価格が変動し、経済的に価値のある材料の代わりに安価なハーブを使用することは、不純物混入と市場不当利得につながっています^8,9。薬用植物の適切な同定と使用の問題を解決するためには、非専門家が発生源¹⁰を特定できる技術が必要である。

薬用植物を外観と匂いだけで適切に識別し、使用するには限界があります¹¹。より正確な同定と品質管理のために、物理化学的方法が採用されています¹²。例えば、薄層クロマトグラフィー(TLC)は、薬草を迅速に同定する方法であり、中国薬局方に含まれています。それにもかかわらず、植物¹³を特定するための参照標準が必要です。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、定性試験と定量試験の両方を実行できるため、医薬品の品質試験に適しています。ただし、この機器は高価であり、^14,15を操作するには専門知識が必要です。DNAバーコード技術は、安定したDNA配列を用いて類似した形態の植物を区別することで、迅速かつ正確な種同定技術です。Hebertらは、ゲノム¹⁶内の認識された比較的短いDNA配列を使用する種を同定するためのDNAバーコード技術を提案し、Chenらは、薬用植物の分子同定のための普遍的な配列としてITS2を提案し、6600以上の植物を同定し、高い同定能力を発見した¹⁷。ITS2および葉緑体遺伝子断片に基づく薬用植物の研究は、資源保護、市場規制、および国際貿易の分野での応用により、種レベルで種を区別する能力を実証している17,18,19。DNAバーコードの適用は、従来の同定方法の限界を克服することができ、これは薬用植物の品質と安全性を確保し、資源の乱用と混乱を防ぐのに役立つ²⁰。これは、薬用植物の研究、持続可能な方法でハーブ産業の成長のサポート、および消費者が正しい薬を使用することの保証を提供するのに有益であることが証明されています21,22,23,24。

この論文では、A. sinensisを例に、DNAバーコーディングを適用して薬用植物を同定する方法のプロトコルを概説しています。DNAバーコードは、生物のDNAに含まれる1つ以上の標準化された短い遺伝子マーカーを利用して、特定の種に属するものとして認識します。現在の薬用植物の同定方法には一定の限界があります。従来の形態学的同定は、専門家の広範な経験に大きく依存しており、これは人的要因の影響を受ける可能性がありますが、化学的同定は主要な化合物の不純物混入などの問題を引き起こしやすい傾向があります。対照的に、DNAバーコードは、より正確な種同定手段を提供し、速度、高い再現性、安定性などの利点を提供します。さらに、この技術により、インターネットや情報プラットフォームを通じて既存の種配列データを一元的に管理・共有することが可能になり、種の同定の効率と信頼性が大幅に向上します^11,12。それらの類似した形態と薬用部分のために、A. sinensisはしばしば他の種と混同され、市場で頻繁に誤用されたり、意図的に置き換えられたりします²⁵。Yangらは、DNAバーコードを使用してA.anomalaを偽の薬物と区別するためにA.anomalaを同定しました²⁶。Yuanらは、アンジェリカの23種を収集し、DNAバーコードを使用してさまざまな種を区別しました²⁷。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーは前処理からバーコード配列とバーコードデータベースとの最終的な照合まで、植物由来の医薬品材料を認証することができます(図1)。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 本研究では、甘粛省ミン県の標高2800mの地点で低温で日照時間が長い2歳の A. sinensis を実験材料として利用しました。3つの植物が選択され、その中から3つ以上の根が実験のために選択されました。最初に滅菌水で根をすすぎ、次にアルコール噴霧器またはアルコール綿棒で根を洗浄して、実験結果の精度に影響を与える可能性のある汚染を防ぎます。滅菌したメスを使用して根を5mm未満に切り、さらに分析するために混合します。(図2)。
   注意: または、根を液体窒素に入れてカリカリにすると、根が折れやすくなります。薬用植物の形や硬さなどの特性に応じて、器具を使って対処してください。
2. 並行実験用の実験サンプルを3本用意します。各サンプルにAS-1、AS-2、AS-3のラベルを付けます。約100 mgの新鮮な組織または20 mgの乾燥重量組織(風乾)を取り、2 mLの遠心分離チューブに入れます。.
3. 2つの5 mmステンレス鋼ビーズを2 mL遠心分離チューブに入れます。チューブを60Hzで60秒間動作するハイスループットティッシュグラインダーに移します。

2 サンプルからのDNA抽出

注:この研究では、CTAB法に基づく植物ゲノムDNA抽出キットを使用しています。DNA抽出は、取扱説明書に従って行われますが、独自のNuclear Isolation Buffer(NIB)を追加するなど、いくつかの変更を加えています。このプロトコルは、最初に組織から汚染物質を分離し、次に最初の核単離ステップ28,29,30を追加することにより、DNAの純度を向上させます。

1. 予冷したNIBを800 μL加え、サンプルをボルテックスミキサーに置き、5分間振動させます。
2. 遠心分離機に入れ、13,780 x g で10分間処理します。上清を取り除きます。
3. 手順2.1〜2.2をさらに3ラウンド繰り返します。
   注:NIBは高品質のDNAを抽出し、その製剤にはドラフトで取り扱わなければならないいくつかの危険な化学物質が含まれているため、初心者が取り扱うのがより困難になります。ただし、この手順は必須ではありません。ユーザーは、この推奨事項に従うか、これらの手順をスキップするかを選択できます。その詳細な定式化を 表1に示します。
4. バッファーP1 600 μL と RNase A (10 mg/mL) 5 μL を添加します。サンプルをボルテックスミキサーに置き、ボルテックスして混合します。サンプルを65°Cのウォーターバスで1.5時間インキュベートし、インキュベーション中にチューブを2〜3回反転させます。
5. 200 μLのBuffer P2を加えて十分に混合し、氷上に15分間置いてから、13,780 x g で10分間遠心分離します。
6. 上清をフィルターカラムAFに慎重に吸引し、13,780 x g で2分間遠心分離し、収集チューブに収集した下部濾液を新しい1.5 mL遠心チューブに移します。
7. 濾液の体積を計算し、P3の体積の1.5倍を加え、すぐに振とうして混合溶液を得ます。
8. 調製した混合物650μLを吸着剤カラム吸着カラム(AC)に加え、5分間インキュベートした後、13,780 x g で30〜60秒間遠心分離します。
9. 手順2.8で得られたろ液を再度ACに加え、遠心分離機にかけ、廃液を捨てます。ステップ2.7の残りの混合溶液で手順を繰り返します。
10. 600 μLのリンス溶液WBを添加し、13,780 x g で30秒間遠心分離し、廃液を廃棄して、手順を1回繰り返します。
11. ACカラムを空の収集チューブに戻し、13,780 x g で2分間遠心分離し、室温で放置して残留エタノールを除去します。
12. 吸着剤カラムACを取り出し、清潔な1.5 mL遠心分離チューブに入れます。65°Cに加熱した吸着膜の中央に、滅菌した脱イオン水45μL(ddH₂O)を加えます。 室温で5分間放置します。13,780 x g で2分間遠心分離します。
13. 得られた溶液をカラムに戻し、13,780 x g で室温で2分間遠心分離します。
14. ろ過した溶液を収集します。分光光度計を使用してDNA濃度を測定します。OD260は核酸の吸光度を表します。DNA品質決定基準には、OD260 / OD280 = 1.80-2.00、正常範囲。OD260/OD280>2.00;大量のRNA汚染があります。OD260 / OD280<1.80、タンパク質、フェノール、およびその他の汚染物質があります。

3 ターゲットフラグメントの増幅と検出

注:植物の提案されたDNAバーコード領域に基づいて適切な増幅プライマーを選択してください。反応条件を 表2に示します。

1. プライマー増幅に対応した反応条件を設定します。9.5 μL の ddH₂O、12.5 μL の 2x PCR Master Mix、およびフォワードプライマー、リバースプライマー、テンプレート DNA をそれぞれ 1 μL 充填した 0.2 mL の遠心分離チューブを使用して、合計容量 25 μL にします。ネガティブコントロールを調製し、テンプレートを水で置き換えます。
2. 1x Tris Acetate-EDTA(TEA)バッファー20 mLとアガロース0.2 gを加えて加熱し、1%アガロースゲルを調製した後、2 μLの核酸ゲル染色剤(10,000倍)を加えて十分に混合します。混合物をゲルキャスティングトレイに注ぎ、固化させてアガロースゲルを得る。3 μL の PCR 産物と 2 μL の DNA マーカー 5000 bp をゲルに加えます。
3. 電圧を120V、電流を400mA、電気泳動を40分間行います。汎用性の高いゲル画像解析システムを使用して、ゲルを表示し、結果を確認します。

4. データの収集と分析

注:さまざまなシーケンスアセンブリおよび分析ソフトウェアがあります。例として、Codon code Aligner V11.0.1とMEGA11を使用しています。

1. アライナーを使用してシーケンシングファイルを開き、ピークマップを観察し、双方向シーケンシングピークマップファイルをスプライスします。
   1. [新しいプロジェクトの作成] を選択し、[OK] をクリックしてソフトウェアのホームページに移動します。FileメニューのAdd Samplesを選択し、シーケンストレース形式で処理するファイルを選択し、Unassembled Samplesでインポートしたファイルとしてソフトウェアに直接インポートします。
   2. [Contig] を選択し、セクションで [Advanced Assembly] を選択し、[Assemble in Groups] を選択します。初めてのユーザーは、[グループで組み立てる] を選択した後、[名前の定義] というダイアログが表示されます。ファイル名に従ってサンプル名パーツを定義し、アセンブルをクリックします。整列されたシーケンスが表示されます。
   3. 隠れマルコフモデル(HMM)ベースのモデル解析に従って、完全なITS2配列を取得します。5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) と 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC) の配列³¹ を使用して、5.8s と 28s の領域を削除するために、最初から整列した配列を検索します。
   4. 「Go」を選択し、セクションで「Search Sequence」を選択し、「OK」をクリックして一致するシーケンスを取得します。[Contig] を選択し、セクションで [Delete] を選択して 5.8s と 28s の領域と低品質のシーケンスを削除すると、ソフトウェアはマッチングのためにスプライシング シーケンスを出力します。
2. 3つの並行実験ステップで得られたスプライシング配列を同定に用いるほか、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のヌクレオチドデータベースを用いた BLAST検索 を選択し、Global Pharmacopoeia Genome Database(GPGD)データベースに対応する Species Identification Tool と Specific Primer ITS2 を選択してください。
   注:NCBI³² およびGPGD³³ には、薬用植物および動物の塩基配列が含まれており、それらは権威あるデータベースとして認識されています。それらの主要な同定方法は、配列比較³⁴ (BLAST)に基づく方法である。同一性の結果からの同一性の割合は、類似性が最も高い種が対象属であるかどうかを判断するために使用されます。
3. 配列のアラインメントにMEGA11を使用し、種内および種間配列の変動を解析および比較し、系統発生的な隣接結合木を構築します。
   1. NCBIからAngelicaの3種とPeucedanum praeruptorumの1種の配列をアウトグループとしてダウンロードしてください。これらの配列を、得られた結果配列とともに解析します。
   2. [ファイル] をクリックし、[ファイル/セッションを開く] を選択してファイルをインポートすると、ダイアログが表示されます。Align > DNAを選択し、配列比較のためにAlign by ClustalWを選択します。「データ」で「系統解析」を選択し、ホームページに戻ります。Construct/Test Neighbor-Joining Tree in PHYLOGENYをクリックします。ソフトウェアは系統樹を生成します。

結果

サンプルDNAの品質

OD260/OD280の吸光度比の範囲は1.80〜1.84であった。分光光度計で測定した各サンプルのDNA量は100 ng/μLを超えており(表3)、サンプルDNA抽出の品質が良好であることを示しています。これは、抽出プロセス中にサンプルがタンパク質、RNA、または試薬によって汚染されておらず、サンプルの品質が良好で、ダ?...

ディスカッション

分子同定技術は、従来の同定方法よりも習得が容易です。それは、植物の成長段階に影響されず、主観的な判断や専門的な専門知識の蓄積に依存しないため、伝統的な薬草の同定の限界を克服する³⁵。他の種は、その類似した形態と薬用部分のために A. sinensis と混同されるが、DNAバーコードを使用することで、それは決定的に識別することが...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.