Aplicación de códigos de barras de ADN para identificar plantas medicinales

Resumen

El presente protocolo describe el uso de la tecnología de códigos de barras de ADN para autenticar materiales medicinales de origen vegetal y la planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels fue identificado como un ejemplo.

Resumen

Las plantas medicinales son recursos valiosos a nivel mundial y se utilizan en todo el mundo para mantener la salud y tratar enfermedades; sin embargo, la presencia de adulteración obstruye su desarrollo. El código de barras de ADN, una técnica para la identificación de especies por regiones estándar de ADN, facilita la identificación rápida y precisa de plantas medicinales tradicionales. El proceso de código de barras de ADN implica seis pasos básicos: 1) procesamiento de las plantas medicinales, 2) extracción de ADN total de alta calidad de las plantas medicinales utilizando el método de columna centrífuga, 3) amplificación del espaciador transcrito interno 2 de la región de ADN objetivo (ITS2) con cebadores universales de plantas y realización de secuenciación Sanger, 4) empalme y alineación de la secuencia para obtener la secuencia objetivo, 5) hacer coincidir la secuencia del código de barras con la biblioteca de códigos de barras para la identificación, 6) alinear la secuencia, comparar la variación intraespecífica e interespecífica, construir un árbol filogenético de unión de vecinos. Como se muestra en los resultados, el cebador universal puede amplificar la región objetivo. La herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) muestra que el porcentaje identificado fue del 100 %, y el árbol de unión de vecinos demuestra que las secuencias de empalme se agruparon con el clado A. sinensis OR879715.1 y el valor de soporte del clado es 100. Este protocolo proporciona una referencia para la aplicación de la tecnología de códigos de barras de ADN como un método eficaz para identificar plantas medicinales y adulterantes.

Introducción

Las plantas medicinales tienen una amplia gama de efectos farmacológicos y son sustancias importantes para el tratamiento y la prevención de enfermedades. La demanda del mercado de plantas medicinales en hierbas medicinales y productos farmacéuticos es enorme y sigue creciendo. Con el aumento del mercado de plantas medicinales, el problema de la adulteración ha obstaculizado el desarrollo de plantas medicinales. En la actualidad, la adulteración de plantas medicinales sufre por las siguientes razones: 1) la morfología similar de las plantas medicinales dificulta su identificación y uso correcto 1,2,3,4,5, 2) la creciente demanda de plantas medicinales ha llevado a una oferta insuficiente en el mercado ^6,7, 3) las plantas medicinales son caras y tienen precios fluctuantes, y el uso de hierbas baratas en lugar de materiales económicamente valiosos ha llevado a la adulteración y a la especulación del mercado ^8,9. Para resolver los problemas de identificación y uso adecuados de las plantas medicinales, existe la necesidad de una tecnología que permita a los no especialistas identificar la fuente¹⁰.

Existen limitaciones para identificar y utilizar adecuadamente las plantas medicinales solo por su apariencia y olor¹¹. Para una identificación y control de calidad más precisos, se emplean métodos fisicoquímicos¹². La cromatografía en capa fina (TLC), por ejemplo, es un método rápido para identificar hierbas medicinales y está incluida en la Farmacopea China. Sin embargo, requiere de estándares de referencia para identificar las plantas¹³. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede realizar pruebas cualitativas y cuantitativas, lo que la hace adecuada para las pruebas de calidad de medicamentos. Sin embargo, este instrumento es costoso y requiere conocimientos especializados para operar^14,15. La tecnología de código de barras de ADN es una tecnología de identificación de especies rápida y precisa que identifica especies mediante el uso de secuencias de ADN estables para diferenciar entre plantas con morfología similar. Hebert et al. propusieron la tecnología de código de barras de ADN para identificar especies, que utiliza una secuencia de ADN reconocida y relativamente corta dentro del genoma¹⁶, Chen et al. propusieron ITS2 como una secuencia universal para la identificación molecular de plantas medicinales e identificaron más de 6600 plantas y encontraron una alta capacidad de identificación¹⁷. El estudio de plantas medicinales basado en ITS2 y fragmentos de genes de cloroplastos ha demostrado la capacidad de distinguir especies a nivel de especie, con aplicaciones en los campos de protección de recursos, regulación del mercado y comercio internacional 17,18,19. La aplicación de códigos de barras de ADN puede superar las limitaciones de los métodos tradicionales de identificación, lo que es útil para garantizar la calidad y la seguridad de las plantas medicinales, evitando el abuso de recursos y la confusión²⁰. Ha demostrado ser beneficioso para el estudio de las plantas medicinales, apoyando el crecimiento de la industria herbal de manera sostenible y proporcionando una garantía de que el consumidor utiliza la medicación correcta 21,22,23,24.

El documento describe los protocolos sobre cómo aplicar el código de barras de ADN para identificar plantas medicinales utilizando A. sinensis como ejemplo. El código de barras de ADN utiliza uno o más marcadores genéticos cortos estandarizados en el ADN de un organismo para reconocerlo como perteneciente a una especie en particular. Los métodos actuales para identificar las plantas medicinales tienen ciertas limitaciones. La identificación morfológica tradicional depende en gran medida de la amplia experiencia de los expertos, que puede verse influenciada por factores humanos, mientras que la identificación química es propensa a problemas como la adulteración de compuestos clave. Por el contrario, el código de barras de ADN proporciona un medio más preciso de identificación de especies, ofreciendo ventajas como velocidad, alta reproducibilidad y estabilidad. Además, esta tecnología permite la gestión centralizada y el intercambio de datos de secuencias de especies existentes a través de Internet y plataformas de información, mejorando significativamente la eficiencia y confiabilidad de la identificación de especies^11,12. Debido a su similar morfología y partes medicinales, A. sinensis a menudo se confunde con otras especies y con frecuencia se utiliza indebidamente o se sustituye intencionalmente en el mercado²⁵. Yang et al. identificaron A. anomala utilizando códigos de barras de ADN para distinguirla de los falsos fármacos²⁶. Yuan et al. recolectaron 23 especies de Angélica y utilizaron códigos de barras de ADN para diferenciar entre las diversas especies²⁷. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios podrán autenticar los materiales medicinales de origen vegetal desde el preprocesamiento hasta la coincidencia final de la secuencia del código de barras con la base de datos de códigos de barras (Figura 1).

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. El presente estudio utilizó como material experimental A . sinensis de dos años de edad con baja temperatura y larga insolación a una altitud de 2800 m del condado de Min, provincia de Gansu. Se seleccionaron tres plantas de las cuales se seleccionaron más de tres raíces para la experimentación. Enjuague las raíces primero con agua esterilizada y luego límpielas con un rociador de alcohol o hisopos con alcohol para evitar la contaminación que podría afectar la precisión de los resultados experimentales. Corta las raíces en trozos de menos de 5 mm con un bisturí esterilizado y mézclalas para su posterior análisis. (Figura 2).
   NOTA: Alternativamente, coloque las raíces en nitrógeno líquido para que queden crujientes, lo que facilita su rotura. Dependiendo de la forma, dureza y otras características de las plantas medicinales, use instrumentos para tratarlas.
2. Prepare tres tubos de muestras experimentales para experimentos paralelos. Etiquete cada muestra como AS-1, AS-2 y AS-3. Tome aproximadamente 100 mg de pañuelo fresco o 20 mg de papel seco (secado al aire) y colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml.
3. Coloque dos perlas de acero inoxidable de 5 mm en los tubos de centrífuga de 2 ml. Transfiera los tubos a una trituradora de tejidos de alto rendimiento que funcione a 60 Hz durante 60 s.

2 Extracción de ADN de la muestra

NOTA: Este estudio utiliza un kit de extracción de ADN genómico de plantas, que se basa en el método CTAB. La extracción de ADN se realiza siguiendo el manual de instrucciones con algunas modificaciones, incluida la adición de un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. El protocolo mejora la pureza del ADN al separar primero los contaminantes del tejido y luego agregar un paso inicial de aislamiento de núcleos 28,29,30.

1. Añadir 800 μL de NIB preenfriado y colocar la muestra en un mezclador de vórtice, vibrando durante 5 min.
2. Colocar en una centrífuga y procesar a 13.780 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
3. Repita los pasos 2.1-2.2 durante 3 rondas adicionales.
   NOTA: NIB extrae ADN de mayor calidad y su preparación contiene algunos productos químicos peligrosos que deben manipularse en una campana extractora, lo que dificulta su manejo para los novatos. Sin embargo, este paso no es obligatorio. Los usuarios pueden optar por seguir esta recomendación u omitir estos pasos. Su formulación detallada se encuentra en la Tabla 1.
4. Añadir 600 μL de tampón P1 y 5 μL de RNasa A (10 mg/mL). Coloque la muestra en un mezclador de vórtice y vórtice para mezclar. Incubar las muestras en un baño de agua a 65 °C durante 1,5 h, invirtiendo los tubos 2x-3x durante la incubación.
5. Añadir 200 μL de tampón P2, mezclar bien, colocar en hielo durante 15 min y, a continuación, centrifugar a 13.780 x g durante 10 min.
6. Aspire cuidadosamente el sobrenadante en una columna de filtro AF, centrifugar a 13.780 x g durante 2 min y transfiera el filtrado inferior recogido en el tubo de recolección a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
7. Calcule el volumen de filtrado, agregue 1,5 veces el volumen de P3 y agite inmediatamente para obtener una solución mezclada.
8. Añadir 650 μL de la mezcla preparada a una columna de adsorción (CA) y fermentar durante 5 min, luego centrifugar a 13.780 x g durante 30-60 s.
9. Agregue el filtrado obtenido del paso 2.8 al aire acondicionado nuevamente, centrifugue y deseche el líquido residual. Repita el procedimiento con la solución mezclada restante del paso 2.7.
10. Añadir 600 μL de solución de enjuague WB, centrifugar a 13.780 x g durante 30 s, desechar la solución de desecho y repetir el procedimiento 1 vez.
11. Vuelva a colocar la columna AC en el tubo de recolección vacío, centrifugue a 13,780 x g durante 2 minutos y déjela a temperatura ambiente para eliminar el etanol residual.
12. Tome la columna de adsorbente AC y colóquela en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 45 μL de agua desionizada esterilizada (ddH₂O) en el centro de la membrana adsorbente, que se ha calentado a 65 °C. Dejar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrífuga a 13.780 x g durante 2 min.
13. Añada la solución resultante de nuevo a la columna y centrifugar a 13.780 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente.
14. Recoja la solución filtrada. Utilice un espectrofotómetro para determinar la concentración de ADN; OD260 representa la absorbancia de los ácidos nucleicos. Utilice los siguientes criterios para el estándar de determinación de la calidad del ADN: OD260 / OD280 = 1.80-2.00, el rango normal; OD260/OD280>2.00; hay una gran cantidad de contaminación por ARN; OD260/OD280<1.80, hay proteínas, fenoles y otros contaminantes.

3 Amplificación y detección de fragmentos de diana

NOTA: Seleccione los cebadores de amplificación apropiados en función de las regiones de código de barras de ADN propuestas por la planta; Las condiciones de reacción se muestran en la Tabla 2.

1. Configure las condiciones de reacción correspondientes a la amplificación del cebador. Utilice tubos de centrífuga de 0,2 mL llenos de 9,5 μL de ddH₂O, 12,5 μL de 2x PCR Master Mix y 1 μL de cebador directo, cebador inverso y ADN molde para un volumen total de 25 μL. Prepare un control negativo, reemplazando la plantilla con agua.
2. Añadir 20 mL de tampón 1x Acetato de Tris-EDTA (TEA) y 0,2 g de agarosa para calentar y preparar un gel de agarosa al 1%, luego añadir 2 μL de tinción de gel de ácido nucleico (10.000x) y mezclar bien. Vierta la mezcla en una bandeja de fundición de gel y deje que se solidifique para obtener el gel de agarosa. Añadir 3 μL del producto PCR y 2 μL de marcador de ADN 5000 pb al gel.
3. Ajuste el voltaje a 120 V, la corriente a 400 mA y la electroforesis a 40 min. Utilice un versátil sistema de análisis de imágenes de gel para ver geles y comprobar los resultados.

4. Recopilación y análisis de datos

NOTA: Existe una amplia gama de software de análisis y ensamblaje de secuencias; utilizamos el código Codon Aligner V11.0.1 y MEGA11 como ejemplos para ilustrar.

1. Utilice el alineador para abrir el archivo de secuenciación para observar el mapa de picos y empalmar los archivos de mapa de picos de secuenciación bidireccional.
   1. Seleccione Crear un nuevo proyecto y haga clic en Aceptar para ir a la página de inicio del software. Seleccione Agregar muestras en el menú Archivo, seleccione el archivo que se procesará como formato de seguimiento de secuencia e impórtelo directamente en el software como el archivo importado en Muestras sin ensamblar.
   2. Elija Contig y, a continuación, en la sección, elija Ensamblaje avanzado y, a continuación, elija Ensamblar en grupos. Los usuarios nuevos, después de seleccionar Ensamblar en grupos, verán este cuadro de diálogo: Elija Definir nombres. Modifique la opción Definir las partes del nombre de la muestra de acuerdo con el nombre del archivo y haga clic en Ensamblar. Se mostrará la secuencia alineada.
   3. Recupere las secuencias ITS2 completas de acuerdo con el análisis de modelo basado en el modelo oculto de Markov (HMM). Utilice las secuencias 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) y 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)³¹ para buscar la secuencia alineada desde el principio para eliminar las regiones 5.8s y 28s.
   4. Seleccione Ir y, a continuación, en la sección, seleccione Secuencia de búsqueda y haga clic en Aceptar para obtener la secuencia coincidente. Elija Contig, elija Eliminar en la sección para eliminar las regiones de 5.8s y 28s y las secuencias de baja calidad, y luego el software generará las secuencias de empalme para que coincidan.
2. Utilice las secuencias de empalme obtenidas de los tres pasos experimentales paralelos para la identificación, seleccione la búsqueda BLAST utilizando la base de datos de nucleótidos en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y seleccione la Herramienta de Identificación de Especies y el Primer Específico ITS2 correspondientes en la base de datos de la Base de Datos del Genoma de la Farmacopea Global (GPGD).
   NOTA: NCBI³² y GPGD³³ incluyen las secuencias de nucleótidos de plantas y animales medicinales y son reconocidas como bases de datos autorizadas. Sus principales métodos de identificación son los métodos basados en la comparación de secuencias³⁴ (BLAST). El porcentaje de identidad de los resultados de identidad se utiliza para determinar si la especie con la mayor similitud es el género objetivo.
3. Utilice MEGA11 para el alineamiento de secuencias, analice y compare la variación de secuencias intraespecíficas e interespecíficas, y construya un árbol filogenético de unión de vecinos.
   1. Descargue las secuencias de tres especies de Angélica y una especie de Peucedanum praeruptorum como un grupo externo del NCBI. Analice estas secuencias junto con la secuencia de resultados obtenida.
   2. Haga clic en Archivo, elija Abrir un archivo/sesión para importar el archivo y aparecerá un cuadro de diálogo. Elija Alinear > ADN y seleccione Alinear por ClustalW para la comparación de secuencias. Elija Análisis filogenético en datos y, a continuación, vuelva a la página de inicio. Haga clic en Construir/Probar árbol de unión de vecinos en FILOGENIA. El software genera un árbol filogenético.

Resultados

Calidad del ADN de la muestra

El rango de relaciones de absorbancia OD260/OD280 fue de 1,80-1,84. La cantidad de ADN medida por espectrofotómetro para cada muestra fue superior a 100 ng/μL (Tabla 3), lo que indica una buena calidad de extracción de ADN de la muestra. Esto indica que las muestras no estaban contaminadas por proteínas, ARN o reactivos durante el proceso de extracción y que eran de buena calidad y adecuadas ...

Discusión

La tecnología de identificación molecular es más fácil de aprender y dominar que los métodos de identificación tradicionales. Supera las limitaciones de la identificación tradicional de las hierbas medicinales, ya que no se ve afectada por la etapa de crecimiento de la planta y no se basa en el juicio subjetivo ni en la acumulación de conocimientos especializados³⁵. Otras especies se confunden con A. sinensis debido a su morfología y partes medic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.