יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בטכנולוגיית ברקוד DNA לאימות חומרים רפואיים מבוססי צמחים, ואת צמח המרפא Angelica sinensis (אוליב). דילס זוהה כדוגמה.

Abstract

צמחי מרפא הם משאבים יקרי ערך ברחבי העולם ומשמשים ברחבי העולם לשמירה על הבריאות ולטיפול במחלות; עם זאת, נוכחות של מהילה חוסמת את התפתחותם. ברקוד DNA, טכניקה לזיהוי מינים על ידי אזורי DNA סטנדרטיים, מאפשר זיהוי מהיר ומדויק של צמחי מרפא מסורתיים. תהליך ברקוד הדנ"א כולל שישה שלבים בסיסיים: 1) עיבוד צמחי המרפא, 2) מיצוי DNA כולל באיכות גבוהה מצמחי המרפא בשיטת עמודה צנטריפוגלית, 3) הגברת DNA המטרה אזור ספייסר פנימי משועתק 2 (ITS2) עם פריימרים אוניברסליים של צמחים וביצוע ריצוף סנגר, 4) שחבור ויישור רצף לקבלת רצף המטרה, 5) התאמת רצף הברקוד לספריית הברקוד לצורך זיהוי, 6) יישור רצף, השוואת שונות תוך-ספציפית ובין-ספציפית, בניית עץ פילוגנטי המחבר שכן. כפי שניתן לראות בתוצאות, הפריימר האוניברסלי יכול להגביר את אזור היעד. כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) מדגים שהאחוז שזוהה היה 100%, והעץ המצטרף לשכן מדגים שרצפי השחבור קובצו עם הקלאדה A. sinensis OR879715.1, וערך התמיכה בקלייד הוא 100. פרוטוקול זה מספק התייחסות ליישום טכנולוגיית ברקוד DNA כשיטה יעילה לזיהוי צמחי מרפא ומהולים.

Introduction

לצמחי מרפא מגוון רחב של השפעות פרמקולוגיות והם חומרים חשובים לטיפול ומניעה של מחלות. הביקוש בשוק לצמחי מרפא בתרופות צמחיות ומוצרי תרופות הוא עצום ועדיין גדל. עם השוק הגובר של צמחי מרפא, הבעיה של מהילה הפריעה לפיתוח של צמחי מרפא. כיום, מהילה צמחי מרפא סובלת מהסיבות הבאות: 1) המורפולוגיה הדומה של צמחי המרפא מקשה על זיהויים והשימוש בהם נכון 1,2,3,4,5, 2) הביקוש הגובר לצמחי מרפא הוביל להיצע לא מספיק בשוק ^6,73) צמחי מרפ....

Protocol

1. הכנת מדגם

1. המחקר הנוכחי השתמש ב- A. sinensis בן שנתיים עם טמפרטורה נמוכה ושמש ארוכה בגובה של 2800 מ 'ממחוז מין, מחוז גאנסו כחומרים ניסיוניים. נבחרו שלושה צמחים מהם נבחרו יותר משלושה שורשים לניסוי. שטפו תחילה את השורשים במים מעוקרים ולאחר מכן נקו אותם עם מרסס אלכוהול או מקלוני אלכוהול כדי למנוע זיהום שעלול להשפיע על דיוק תוצאות הניסוי. חותכים את השורשים לחתיכות קטנות מ -5 מ"מ באמצעות אזמל מעוקר ומערבבים לניתוח נוסף. (איור 2).
   הערה: לחלופין, הניחו את השורשים בחנקן נוזלי כדי להתחדד, מה שמקל על פירוקם. בהתאם לצורה, קשיות ומאפיינים אחרים של צמחי המרפא, השתמש במכשירים כד....

תוצאות

איכות DNA לדוגמה

טווח יחסי הספיגה של OD260/OD280 היה 1.80-1.84. כמות הדנ"א שנמדדה על ידי ספקטרופוטומטר עבור כל דגימה הייתה גדולה מ-100 ננוגרם/מיקרוליטר (טבלה 3), מה שמצביע על איכות טובה של מיצוי דנ"א דגימה. הדבר מצביע על כך שהדגימות לא זוהמו על ידי חלבון,.......

Discussion

טכנולוגיית זיהוי מולקולרית קלה יותר ללמידה ולשליטה מאשר שיטות זיהוי מסורתיות. הוא מתגבר על מגבלות הזיהוי המסורתי של צמחי מרפא, שכן הוא אינו מושפע משלב הצמיחה של הצמח ואינו מסתמך על שיפוט סובייקטיבי או על צבירת מומחיות מיוחדת³⁵ . מינים אחרים מבולבלים עם A. sin.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.