JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בטכנולוגיית ברקוד DNA לאימות חומרים רפואיים מבוססי צמחים, ואת צמח המרפא Angelica sinensis (אוליב). דילס זוהה כדוגמה.

Abstract

צמחי מרפא הם משאבים יקרי ערך ברחבי העולם ומשמשים ברחבי העולם לשמירה על הבריאות ולטיפול במחלות; עם זאת, נוכחות של מהילה חוסמת את התפתחותם. ברקוד DNA, טכניקה לזיהוי מינים על ידי אזורי DNA סטנדרטיים, מאפשר זיהוי מהיר ומדויק של צמחי מרפא מסורתיים. תהליך ברקוד הדנ"א כולל שישה שלבים בסיסיים: 1) עיבוד צמחי המרפא, 2) מיצוי DNA כולל באיכות גבוהה מצמחי המרפא בשיטת עמודה צנטריפוגלית, 3) הגברת DNA המטרה אזור ספייסר פנימי משועתק 2 (ITS2) עם פריימרים אוניברסליים של צמחים וביצוע ריצוף סנגר, 4) שחבור ויישור רצף לקבלת רצף המטרה, 5) התאמת רצף הברקוד לספריית הברקוד לצורך זיהוי, 6) יישור רצף, השוואת שונות תוך-ספציפית ובין-ספציפית, בניית עץ פילוגנטי המחבר שכן. כפי שניתן לראות בתוצאות, הפריימר האוניברסלי יכול להגביר את אזור היעד. כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) מדגים שהאחוז שזוהה היה 100%, והעץ המצטרף לשכן מדגים שרצפי השחבור קובצו עם הקלאדה A. sinensis OR879715.1, וערך התמיכה בקלייד הוא 100. פרוטוקול זה מספק התייחסות ליישום טכנולוגיית ברקוד DNA כשיטה יעילה לזיהוי צמחי מרפא ומהולים.

Introduction

לצמחי מרפא מגוון רחב של השפעות פרמקולוגיות והם חומרים חשובים לטיפול ומניעה של מחלות. הביקוש בשוק לצמחי מרפא בתרופות צמחיות ומוצרי תרופות הוא עצום ועדיין גדל. עם השוק הגובר של צמחי מרפא, הבעיה של מהילה הפריעה לפיתוח של צמחי מרפא. כיום, מהילה צמחי מרפא סובלת מהסיבות הבאות: 1) המורפולוגיה הדומה של צמחי המרפא מקשה על זיהויים והשימוש בהם נכון 1,2,3,4,5, 2) הביקוש הגובר לצמחי מרפא הוביל להיצע לא מספיק בשוק 6,73) צמחי מרפא הם יקרים ויש להם מחירים משתנים, והשימוש בעשבי תיבול זולים במקום בחומרים בעלי ערך כלכלי הוביל למהילה ולרווחי שוק 8,9. כדי לפתור את הבעיות של זיהוי נכון ושימוש בצמחי מרפא, יש צורך בטכנולוגיה המאפשרת ללא מומחים לזהות את המקור10.

ישנן מגבלות לזיהוי נכון ושימוש נכון בצמחי מרפא לפי מראה וריח בלבד11. לזיהוי מדויק יותר ובקרת איכות, שיטות פיסיקוכימיות משמשות12. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC), למשל, היא שיטה מהירה לזיהוי צמחי מרפא ונכללת בפרמקופיאה הסינית. עם זאת, הוא דורש תקני ייחוס כדי לזהות את הצמחים13. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) יכולה לבצע בדיקות איכותיות וכמותיות כאחד, מה שהופך אותה למתאימה לבדיקת איכות הרפואה. עם זאת, מכשיר זה הוא יקר ודורש ידע מיוחד כדי להפעיל 14,15. טכנולוגיית ברקוד DNA היא טכנולוגיה מהירה ומדויקת לזיהוי מינים המזהה מינים באמצעות רצפי DNA יציבים כדי להבדיל בין צמחים בעלי מורפולוגיה דומה. Hebert et al. הציעו טכנולוגיית ברקוד DNA לזיהוי מינים, המשתמשת ברצף DNA מוכר וקצר יחסית בתוך הגנום16, Chen et al. הציעו את ITS2 כרצף אוניברסלי לזיהוי מולקולרי של צמחי מרפא וזיהו יותר מ 6600 צמחים ומצאו יכולת זיהוי גבוהה17. חקר צמחי מרפא המבוססים על מקטעי גנים ITS2 וכלורופלסט הוכיח את היכולת להבחין בין מינים ברמת המינים, עם יישומים בתחומי הגנת משאבים, תקנת שוק וסחר בינלאומי 17,18,19. היישום של ברקוד DNA יכול להתגבר על המגבלות של שיטות זיהוי מסורתיות, אשר מסייע להבטיח את האיכות והבטיחות של צמחי מרפא, מניעת ניצול לרעה של משאבים ובלבול20. זה הוכח מועיל לחקר צמחי מרפא, תמיכה בצמיחה של תעשיית הצמחים באופן בר קיימא, ומתן ערובה כי הצרכן משתמש בתרופה הנכונה 21,22,23,24.

המאמר מתאר פרוטוקולים כיצד ליישם ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא באמצעות A. sinensis כדוגמה. ברקוד דנ"א משתמש בסמן גנטי קצר סטנדרטי אחד או יותר בדנ"א של אורגניזם כדי לזהות אותו כשייך למין מסוים. לשיטות הנוכחיות לזיהוי צמחי מרפא יש מגבלות מסוימות. זיהוי מורפולוגי מסורתי מסתמך במידה רבה על ניסיונם הרב של מומחים, אשר יכול להיות מושפע מגורמים אנושיים, בעוד זיהוי כימי נוטה לבעיות כמו מהילה של תרכובות מפתח. לעומת זאת, ברקוד DNA מספק אמצעי מדויק יותר לזיהוי מינים, ומציע יתרונות כגון מהירות, יכולת רבייה גבוהה ויציבות. יתר על כן, טכנולוגיה זו מאפשרת ניהול ושיתוף מרכזי של נתוני רצף מינים קיימים באמצעות האינטרנט ופלטפורמות מידע, ומשפרת משמעותית את היעילות והאמינות של זיהוי מינים11,12. בשל המורפולוגיה והחלקים הרפואיים הדומים שלהם, A. sinensis מבולבל לעתים קרובות עם מינים אחרים ולעתים קרובות נעשה בו שימוש לרעה או מוחלף בכוונה בשוק25. יאנג ועמיתיו זיהו את A. anomala באמצעות ברקוד DNA כדי להבדיל אותו מסמים מזויפים26. יואן ועמיתיו אספו 23 מינים של אנג'ליקה והשתמשו בברקוד דנ"א כדי להבדיל בין המינים השונים27. על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים יוכלו לאמת חומרים רפואיים מבוססי צמחים משלב העיבוד המקדים ועד להתאמה הסופית של רצף הברקוד למסד הנתונים של הברקוד (איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מדגם

  1. המחקר הנוכחי השתמש ב- A. sinensis בן שנתיים עם טמפרטורה נמוכה ושמש ארוכה בגובה של 2800 מ 'ממחוז מין, מחוז גאנסו כחומרים ניסיוניים. נבחרו שלושה צמחים מהם נבחרו יותר משלושה שורשים לניסוי. שטפו תחילה את השורשים במים מעוקרים ולאחר מכן נקו אותם עם מרסס אלכוהול או מקלוני אלכוהול כדי למנוע זיהום שעלול להשפיע על דיוק תוצאות הניסוי. חותכים את השורשים לחתיכות קטנות מ -5 מ"מ באמצעות אזמל מעוקר ומערבבים לניתוח נוסף. (איור 2).
    הערה: לחלופין, הניחו את השורשים בחנקן נוזלי כדי להתחדד, מה שמקל על פירוקם. בהתאם לצורה, קשיות ומאפיינים אחרים של צמחי המרפא, השתמש במכשירים כדי להתמודד איתם.
  2. הכינו שלוש מבחנות של דגימות ניסוי לניסויים מקבילים. תייג כל דגימה כ- AS-1, AS-2 ו- AS-3. קחו כ-100 מ"ג רקמה טרייה או 20 מ"ג רקמה יבשה (מיובשת באוויר) והניחו אותה בצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
  3. הכניסו שני חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ לצינורות הצנטריפוגות בנפח 2 מ"ל. העבר את הצינורות למטחנת רקמות בעלת תפוקה גבוהה הפועלת ב- 60 הרץ למשך 60 שניות.

2 מיצוי DNA מדגימה

הערה: מחקר זה משתמש בערכת מיצוי DNA גנומי של צמחים, המבוססת על שיטת CTAB. מיצוי DNA מתבצע על פי מדריך ההוראות עם כמה שינויים, כולל תוספת של מאגר בידוד גרעיני ייחודי (NIB). הפרוטוקול משפר את טוהר הדנ"א על ידי הפרדת המזהמים מהרקמה ולאחר מכן הוספת שלב בידוד גרעינים ראשוני 28,29,30.

  1. מוסיפים 800 μL של NIB מקורר מראש ומניחים את הדגימה על מערבל מערבולת, רוטט במשך 5 דקות.
  2. מניחים בצנטריפוגה ומעבדים במהירות של 13,780 x גרם למשך 10 דקות. הסר את supernatant.
  3. חזור על שלבים 2.1-2.2 במשך 3 סבבים נוספים.
    הערה: NIB מחלץ DNA באיכות גבוהה יותר, וההכנה שלו מכילה כמה כימיקלים מסוכנים שיש לטפל בהם במכסה אדים, מה שמקשה על טירונים להתמודד. עם זאת, צעד זה אינו חובה. משתמשים יכולים לבחור לעקוב אחר המלצה זו או לדלג על שלבים אלה. ניסוחו המפורט נמצא בטבלה 1.
  4. הוסף 600 μL של Buffer P1 ו 5 μL של RNase A (10 מ"ג / מ"ל). מניחים את הדגימה על מערבל מערבולת ומערבולת לערבוב. לדגור את הדגימות באמבט מים ב 65 ° C במשך 1.5 שעות, להפוך את הצינורות 2x-3x במהלך הדגירה.
  5. מוסיפים 200 μL של Buffer P2, מערבבים היטב, מניחים על קרח למשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13,780 x גרם למשך 10 דקות.
  6. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט על עמוד מסנן AF, צנטריפוגה בגודל 13,780 x גרם למשך 2 דקות, והעבירו את התסנין התחתון שנאסף בצינור האיסוף לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  7. חשב את נפח התסנין, הוסף פי 1.5 נפח P3, ונער מיד כדי לקבל תמיסה מעורבת.
  8. מוסיפים 650 μL של התערובת המוכנה לעמוד ספיחה של עמוד ספיחה (AC) ודגרים במשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה ב 13,780 x גרם במשך 30-60 שניות.
  9. הוסיפו שוב את התסנין שהתקבל משלב 2.8 למזגן, צנטריפוגה והשליכו את נוזל הפסולת. חזור על ההליך עם התמיסה המעורבת הנותרת משלב 2.7.
  10. הוסף 600 μL של תמיסת שטיפה WB, צנטריפוגה ב 13,780 x גרם במשך 30 שניות, להשליך את תמיסת הפסולת, ולחזור על התהליך 1x.
  11. החזירו את עמוד המזגן לצינור האיסוף הריק, לצנטריפוגה בגודל 13,780 x גרם למשך 2 דקות, והשאירו בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות אתנול.
  12. קח את עמוד הספיגה AC ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. הוסף 45 μL של מים מעוקרים deionized (ddH2O) למרכז קרום סופח, אשר כבר מחומם ל 65 ° C. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 13,780 x גרם למשך 2 דקות.
  13. הוסף את התמיסה המתקבלת בחזרה לעמוד ולצנטריפוגה במהירות של 13,780 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. אסוף את הפתרון המסונן. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA; OD260 מייצג את הספיגה של חומצות גרעין. השתמש בקריטריונים הבאים עבור תקן קביעת איכות DNA: OD260/OD280=1.80-2.00, הטווח הנורמלי; OD260/OD280>2.00; יש כמות גדולה של זיהום RNA; OD260/OD280<1.80, ישנם חלבונים, פנולים ומזהמים אחרים.

3 הגברה וגילוי של שברי מטרה

הערה: בחר פריימרים מתאימים להגברה בהתבסס על אזורי ברקוד ה- DNA המוצעים של הצמח; תנאי התגובה מוצגים בטבלה 2.

  1. הגדר את תנאי התגובה המתאימים להגברת פריימר. השתמש בצינורות צנטריפוגות של 0.2 מ"ל מלאים ב- 9.5 μL של ddH2O, 12.5 μL של 2x PCR Master Mix, ו- 1 μL כל אחד של פריימר קדמי, פריימר הפוך ו- DNA של תבנית לנפח כולל של 25 μL. הכן בקרה שלילית, והחליף את התבנית במים.
  2. מוסיפים 20 מ"ל של חיץ 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) ו-0.2 גרם אגרוז לחימום ומכינים ג'ל אגרוז 1%, ואז מוסיפים 2 μL של כתם ג'ל חומצת גרעין (10,000x) ומערבבים היטב. יוצקים את התערובת לתוך מגש יציקת ג'ל ומאפשרים לה להתמצק כדי לקבל את ג'ל האגרוז. הוסף 3 μL של מוצר PCR ו 2 μL של סמן DNA 5000 bp לג'ל.
  3. הגדר את המתח על 120 V, את הזרם על 400 mA, אלקטרופורזה למשך 40 דקות. השתמש במערכת ניתוח תמונות ג'ל רב-תכליתית כדי להציג ג'לים ולבדוק את התוצאות.

4. איסוף וניתוח נתונים

הערה: קיים מגוון רחב של תוכנות הרכבה וניתוח רצפים; אנו משתמשים בקוד קודון Aligner V11.0.1 ו- MEGA11 כדוגמאות להמחשה.

  1. השתמש ביישור כדי לפתוח את קובץ הרצף כדי לצפות במפת הפסגות ולפרוס את קובצי מפת הפסגות של הרצף הדו-כיווני.
    1. בחר צור פרוייקט חדש ולחץ על אישור כדי לעבור לדף הבית של התוכנה. בחר Add Samples בתפריט File, בחר את הקובץ שיעובד כתבנית מעקב אחר רצף, וייבא אותו ישירות לתוכנה כקובץ המיובא ב- Unassembled Samples.
    2. בחר Contig ולאחר מכן, במקטע, בחר הרכבה מתקדמת ולאחר מכן בחר הרכיב בקבוצות. משתמשים בפעם הראשונה, לאחר בחירת הרכיב בקבוצות, יראו את תיבת הדו-שיח הבאה: בחר הגדר שמות. שנה את חלקי השם לדוגמה Define בהתאם לשם הקובץ ולחץ על Assemble. הרצף המיושר יוצג.
    3. אחזר את רצפי ITS2 המלאים בהתאם לניתוח מודל מוסתר מבוסס מרקוב (HMM). השתמש ברצפים 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) ו- 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 כדי לחפש את הרצף המיושר מההתחלה כדי להסיר את האזורים 5.8s ו- 28s.
    4. בחר בצע, ולאחר מכן, במקטע, בחר רצף חיפוש ולחץ על אישור כדי לקבל את הרצף התואם. בחר Contig, בחר מחק במקטע כדי להסיר את אזורי 5.8s ו- 28s ואת הרצפים באיכות נמוכה, ולאחר מכן התוכנה תפיק את רצפי השחבור להתאמה.
  2. השתמש ברצפי השחבור שהתקבלו משלושת שלבי הניסוי המקבילים לזיהוי, בחר חיפוש BLAST באמצעות מסד הנתונים של הנוקלאוטידים במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), ובחר את כלי זיהוי המינים ואת פריימר ITS2 הספציפי המתאים במסד הנתונים Global Pharmacopoeia Genome Database (GPGD).
    הערה: NCBI32 ו- GPGD33 כוללים את רצפי הנוקלאוטידים של צמחי מרפא ובעלי חיים והם מוכרים כמאגרי מידע מוסמכים. שיטות הזיהוי העיקריות שלהם הן השיטות המבוססות על השוואת רצפים34 (BLAST). אחוז הזהות מתוצאות הזהות משמש כדי לקבוע אם המין בעל הדמיון הרב ביותר הוא סוג היעד.
  3. השתמש ב- MEGA11 ליישור רצפים, נתח והשווה שונות רצף תוך ספציפית ובין-ספציפית, ובנה עץ פילוגנטי המחבר שכן.
    1. הורד את הרצפים של שלושה מינים של אנג'ליקה ומין אחד של Peucedanum praeruptorum כקבוצת חוץ מ- NCBI. נתח רצפים אלה יחד עם רצף התוצאות המתקבל.
    2. לחצו על 'קובץ', בחרו 'פתח קובץ/הפעלה ' לייבוא הקובץ, ותיבת דו-שיח תופיע. בחר Align > DNA ובחר Align by ClustalW להשוואת רצפים. בחר ניתוח פילוגנטי בנתונים ולאחר מכן חזור לדף הבית. לחץ על בנה/בדוק עץ הצטרפות שכנים ב- PHYLOGENY. התוכנה מייצרת עץ פילוגנטי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איכות DNA לדוגמה

טווח יחסי הספיגה של OD260/OD280 היה 1.80-1.84. כמות הדנ"א שנמדדה על ידי ספקטרופוטומטר עבור כל דגימה הייתה גדולה מ-100 ננוגרם/מיקרוליטר (טבלה 3), מה שמצביע על איכות טובה של מיצוי דנ"א דגימה. הדבר מצביע על כך שהדגימות לא זוהמו על ידי חלבון,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

טכנולוגיית זיהוי מולקולרית קלה יותר ללמידה ולשליטה מאשר שיטות זיהוי מסורתיות. הוא מתגבר על מגבלות הזיהוי המסורתי של צמחי מרפא, שכן הוא אינו מושפע משלב הצמיחה של הצמח ואינו מסתמך על שיפוט סובייקטיבי או על צבירת מומחיות מיוחדת35 . מינים אחרים מבולבלים עם A. sin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הצגת האדם המוכשר מחקר מדעי להתחיל מימון פרויקט סבסוד של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (030040015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MSuitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acidBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BAdoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEQuantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidoneShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice MakerShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue HomogenizerBeyotime Biotechnology. F6623Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath KettleShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.

References

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DNADNAITS2BLAST

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved