Aplicação de código de barras de DNA para identificar plantas medicinais

Resumo

O presente protocolo descreve o uso da tecnologia de código de barras de DNA para autenticar materiais medicinais à base de plantas, e a planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels foi identificado como um exemplo.

Resumo

As plantas medicinais são recursos valiosos em todo o mundo e são usadas em todo o mundo para manter a saúde e tratar doenças; no entanto, a presença de adulteração obstrui seu desenvolvimento. O código de barras de DNA, uma técnica para identificação de espécies por regiões de DNA padrão, facilita a identificação rápida e precisa de plantas medicinais tradicionais. O processo de código de barras de DNA envolve seis etapas básicas: 1) processamento das plantas medicinais, 2) extração de DNA total de alta qualidade das plantas medicinais usando o método da coluna centrífuga, 3) amplificação do espaçador transcrito interno da região do DNA alvo 2 (ITS2) com primers universais de plantas e realização do sequenciamento de Sanger, 4) emenda e alinhamento da sequência para obter a sequência alvo, 5) combinar a sequência do código de barras com a biblioteca de códigos de barras para identificação, 6) alinhar a sequência, comparando a variação intraespecífica e interespecífica, construindo a árvore filogenética de junção de vizinhos. Conforme mostrado nos resultados, o primer universal pode amplificar a região-alvo. A Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) demonstra que a porcentagem identificada foi de 100%, e a árvore de junção de vizinhos demonstra que as sequências de splicing foram agrupadas com o clado A. sinensis OR879715.1 e o valor de suporte do clado é 100. Este protocolo fornece uma referência para a aplicação da tecnologia de código de barras de DNA como um método eficaz para identificar plantas medicinais e adulterantes.

Introdução

As plantas medicinais têm uma ampla gama de efeitos farmacológicos e são substâncias importantes para o tratamento e prevenção de doenças. A demanda do mercado por plantas medicinais em medicamentos fitoterápicos e produtos farmacêuticos é enorme e ainda está crescendo. Com o aumento do mercado de plantas medicinais, o problema da adulteração tem dificultado o desenvolvimento de plantas medicinais. Atualmente, a adulteração de plantas medicinais sofre dos seguintes motivos: 1) a morfologia semelhante das plantas medicinais dificulta sua identificação e uso correto 1,2,3,4,5, 2) a crescente demanda po....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. O presente estudo utilizou A. sinensis , de dois anos de idade, com baixa temperatura e longa luz do sol, a uma altitude de 2800 m do condado de Min, província de Gansu, como materiais experimentais. Foram selecionadas três plantas, das quais mais de três raízes foram selecionadas para experimentação. Enxágue as raízes primeiro com água esterilizada e depois limpe-as com um pulverizador de álcool ou cotonetes com álcool para evitar contaminação que possa afetar a precisão dos resultados experimentais. Corte as raízes em pedaços menores que 5 mm usando um bisturi esterilizado....

Discussão

A tecnologia de identificação molecular é mais fácil de aprender e dominar do que os métodos tradicionais de identificação. Ele supera as limitações da identificação de ervas medicinais tradicionais, pois não é afetado pelo estágio de crescimento da planta e não depende de julgamento subjetivo ou do acúmulo de conhecimento especializado³⁵. Outras espécies são confundidas com A. sinensis devido à sua morfologia e partes medicinais semelh.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit	Shanghai Huiling Biotechnology Co.	NG411M	Suitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA Marker	Nanjing vazyme Bio-technology Co.	MD102-02	Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co.	DYY-6C	Adopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acid	BeijingpsaitongBiotechnologyCo.,Ltd	E70015-100G	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)	Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	10201ES03	When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop Centrifuge	Changsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.	H1650	For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue Grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co.	Tiss-48	A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/	Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences	-	HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/	U.S. National Library of Medicine	-	The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-Bell	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.	VORTEX-5	Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouch	Hangzhou BORI Technology Co.	TC-96/G/H(b)B	Adoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis System	Southwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.	Tanon-Mini Space 2000	Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	S8210-100	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop One	Genes Ltd.	ND ONE	Quantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidone	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S30268-500g	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice Maker	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.	ZX-60X	Adopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue Homogenizer	Beyotime Biotechnology.	F6623	Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA buffer	Beyotime Biotech Inc	ST716	TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HCl	Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.	T8230	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath Kettle	Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.	DK-8D	Precise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanol	Shanghai Eon Chemical Technology Co.	R054186-100ml	Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.