在离体模型中全面表征组织矿化

摘要

拟议的协议需要一种全球方法，使用多模态分析在骨再生的背景下评估骨形成。它旨在提供有关新骨形成的定性和定量信息，提高基础和临床前研究的严谨性和有效性。

摘要

鉴于目前可用于分析的多种方式，在骨再生的背景下对组织矿化进行广泛的表征是一项重大挑战。在这里，我们提出了一种使用相关的大型动物 骨离体外植 体全面评估新骨形成的工作流程。在外植的绵羊股骨头中产生骨缺损（直径 = 3.75 毫米;深度 = 5.0 毫米），并注射载有促成骨生长因子（骨形态发生蛋白 2 - BMP2）的大孔骨替代物。随后，外植体在培养物中维持 28 天，允许细胞定植和随后的骨形成。为了评估新矿化组织的质量和结构，建立了以下连续的方法：（i） 使用显微 CT 对整个外植体进行表征和高分辨率 3D 图像，然后进行深度学习图像分析以增强对矿化组织的区分;（ii） 纳米压痕以确定新形成组织的机械性能;（iii） 组织学检查，例如苏木精/伊红/藏红花 （HES）、Goldner 三色和 Movat 五色，以提供矿化组织的定性评估，特别是关于类骨屏障的可视化和骨细胞的存在;（iv） 背向散射扫描电子显微镜 （SEM） 映射与内部参考，以量化矿化程度，并提供对表面形态、矿物成分和骨骼-生物材料界面的详细见解;（v） 拉曼光谱，用于表征矿化基质的分子组成，并通过检测肽键来深入了解 BMP2 在胶结中的持久性。这种多模式分析将提供对新形成的骨骼的有效评估，并对矿化组织进行全面的定性和定量分析。通过这些协议的标准化，我们的目标是促进研究间比较并提高研究结果的有效性和可靠性。

引言

骨缺损，无论是由创伤、肿瘤切除、先天性异常还是感染引起的，都是再生医学面临的主要挑战。这些改变损害了骨骼系统的结构完整性，导致不适、功能障碍和患者生活质量的降低。

为了克服这些挑战，出现了创新的骨修复策略，重点是增强成骨和骨组织再生。这些方法包括使用植入式、注射式或 3D 打印的骨替代物，这些替代物可以是天然来源（例如，生物来源的大分子、动物来源的羟基磷灰石）或合成来源（例如，生物玻璃、磷酸钙）¹。为了增强其引导和刺激骨再生的低固有能力，骨替代品可以加载成骨诱导因子，例如骨形态发生蛋白 （BMP），以促进祖细胞的成骨分化并增强骨形成²。

骨骼形成基于胶原蛋白基质的初始形成，然后被羟基磷灰石晶体矿化，从而加强骨骼结构³。这个过程赋予骨骼特定的刚度和强度。矿化组织的质量受其微观结构属性和矿化程度的复杂控制⁴。这种品质在骨骼愈合和再生骨骼的功能中起着关键作用⁵。然而，由于多变量研究的固有可变性，表征骨矿化仍然是一项具有挑战性的任务 ^6,7,8

研究方案

这项研究已获得伦理和动物福利委员会以及法国国家兽医和食品管理局的批准，编号为 G44171。

1. 骨软骨外植体的制备和培养

1. 在无菌环境中从新鲜安乐死的动物中收获羊关节标本。将绵羊置于仰卧位，剃掉左后肢。用酒精对膝关节周围进行消毒。使用外侧髌旁关节切开术暴露前交叉韧带和后交叉韧带，然后进行髌骨脱位以暴露股滑车。
   1. 组织采集后，使用骨软骨自体移植系统在外侧髁上创建一个直径为 4.75 毫米的缺损。
2. 使用骨锤，创建一个 10 毫米深的缺损，并从髁突中取出外植体。随后，使用骨软骨自体移植系统进行直径为 8 mm 的第二个缺损，以第一个缺损为中心。这产生了尺寸为 8 mm x 10 mm 的骨软骨外植体，其中包含 4.75 mm x 10.0 mm 的中心缺损。
3. 如果出于物流原因需要，将外植体在补充有 1% 青霉素 - 链霉素的 Hank 平衡盐溶液 （hBSS） 中运输，并在 4 °C 下储存。
4. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗外植体 3 次，然后用补充有 40 μg/mL BMP2 的磷酸钙水泥注入 4.75 mm x 10.0 mm 缺损。如下所述准备水泥。
   1. 通过在 1364 °C 下对极饱和磷酸三钙棒（120 MPa 等静压）进行热处理至少 12....

讨论

修复骨缺损是再生医学中恢复活动能力、减轻疼痛和改善受影响个体生活质量的主要挑战。与体内研究相比，使用外植体模型在研究骨缺损修复方面具有许多优势。除了伦理考虑外，该模型还允许严格控制实验条件并减少生物变异性，从而促进产生更准确和可重复的结果。此外，与其他动物相比，羊骨的机械和生物学特性与人类骨骼的机械和生物学特性密切相关

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1